牡丹籽粕酶解多肽饲料工艺研究

张惠喜，宋红卫，肖 猛，孙启亮，袁国良

（菏泽市食品药品检验检测研究院，山东 菏泽274000）

油用牡丹是我国新型的木本油料植物，2011年国家卫生部批准牡丹籽油为新资源食品[1]。牡丹籽粕是压榨牡丹籽油的副产物，在牡丹籽油制备过程中牡丹籽粕产出率为25%～30%[2]，每年大量用于榨油后的牡丹籽粕被废弃，经检测牡丹籽粕中蛋白质含量在30%左右，而且氨基酸种类全面，可以开发为一种蛋白质饲料原料[3-4]。

研究表明，生物机体对蛋白质的吸收并不全是以氨基酸形式，小分子多肽因具有重要的生理功效而被机体吸收利用[5]。通过水解蛋白质可以得到易于机体消化吸收的小分子多肽，由于酸或碱水解法对蛋白质破坏程度大，一般不用于制备蛋白质水解产品[6]，而酶水解法作用条件温和，能够保持蛋白质的活性，常常用于制备具有生物活性的多肽类产品[7]。

本试验利用碱性蛋白酶水解牡丹籽粕制备蛋白质多肽饲料产品，以期为牡丹籽粕在畜禽养殖上的利用奠定基础。

1 材料

1.1 原料与试剂

牡丹籽粕，菏泽天宝牡丹有限公司产品；碱性蛋白酶（批号为S101054），上海源叶生物科技有限公司产品；氢氧化钠、盐酸等，均分析纯级。

1.2 仪器与设备

K9870型凯氏定氮仪，济南海能仪器股份有限公司产品；SHA-C型水浴恒温振荡器，天津赛得利斯实验分析仪器制造厂产品；SK15型离心机，Sigma公司产品；FE20K型台式酸度计，梅特勒-托利公司产品。

2 方法

2.1 牡丹籽粕多肽的提取工艺流程

按1：20（W/V）的料液比配制牡丹籽粕悬混液，用1.0 mol·L-1HCl或NaOH调节pH至设定值，加入设定比例的碱性蛋白酶，于水浴中恒温酶解。在此期间不断加入0.5 mol·L-1NaOH以保持溶液的pH不变，并记录NaOH溶液的消耗量。反应完成后，将酶解液于95℃沸水浴中灭活10 min，冷却至室温，再6 000 r·min-1离心10 min，过滤后即得牡丹籽粕酶解多肽。

2.2 牡丹籽粕蛋白水解度的测定

根据pH-state法[8]计算牡丹籽粕蛋白水解度（DH）。具体公式如下[9]：

式 中：C为NaOH溶 液 浓 度（mol·L-1），V为NaOH溶液消耗体积（mL），α为氨基的离解度；m为样品蛋白质质量（g），h为每克原料牡丹籽粕蛋白中肽键的毫摩尔数，h=7.84 mmol·g-1，T为试验温度（K）。

2.3 单因素试验

2.3.1 温度对牡丹籽粕蛋白酶解效果影响

按1：20（W/V）的料液比配制牡丹籽粕悬混液，用1.0 mol·L-1HCl或NaOH调节溶液的pH=7.5，加入1.0%的碱性蛋白酶，分别在50℃、55℃、60℃、65℃水浴锅中保温酶解2.0 h，期间不断加入0.5 mol·L-1的NaOH溶液以保持溶液的pH不变，记录消耗的加碱量，分析酶解温度对牡丹籽粕蛋白酶解效果的影响。

2.3.2 pH对牡丹籽粕蛋白酶解效果的影响

按1：20（W/V）的料液比配制牡丹籽粕悬混液，在60℃水浴锅中保温，加入1.0%的碱性蛋白酶，用1.0 mol·L-1HCl或NaOH调节溶液的pH分别为6.5、7.0、7.5、8.0，酶解2.0 h，期间不断加入0.5 mol·L-1NaOH以保持溶液的pH不变，记录消耗的碱量，分析pH对牡丹籽粕蛋白酶解效果的影响。

2.3.3 酶浓度对牡丹籽粕蛋白酶解效果的影响

按1：20（W/V）的料液比配制牡丹籽粕悬混液，用1.0 mol·L-1HCl或NaOH调节溶液的pH=7.5，并在60℃水浴锅中保温，分别加入浓度为0.6%、0.8%、1.0%、1.2%的碱性蛋白酶，酶解2.0 h，期间不断加入0.5 mol·L-1NaOH以保持溶液的pH不变，记录消耗的碱量，分析酶浓度对牡丹籽粕蛋白酶解效果的影响。

2.3.4 反应时间对牡丹籽粕蛋白酶解效果的影响

按1：20（W/V）的料液比配制牡丹籽粕悬混液，用1.0 mol·L-1HCl或NaOH调节溶液的pH=7.5，并在60℃水浴锅中保温，此时加入1.0%的碱性蛋白酶，分别酶解1.0 h、2.0 h、3.0 h、4.0 h，期间不断加入0.5 mol·L-1NaOH以保持溶液的pH不变，记录消耗的加碱量，分析反应时间对牡丹籽粕蛋白酶解工艺的影响。

2.4 正交试验确定最佳工艺条件

依据单因素试验结果，以水解度为指标，进行正交试验，正交试验因素水平见表1。

表1 正交试验因素水平

3 结果与分析

3.1 单因素试验

3.1.1 温度对牡丹籽粕蛋白酶解效果的影响

温度是影响蛋白酶解最重要的因素之一，过高或过低均会影响酶的活力，进而影响酶解过程。当温度升高时，反应速度也加快，另一方面，温度过高也会使蛋白质变性沉降，阻碍蛋白质与酶的接触，从而影响酶解效果[10]。本试验中，随着酶解温度从50℃升高到60℃时，牡丹籽粕蛋白DH逐渐升高，从开始的10.02%增大到17.25%，当酶解温度超过60℃后，DH逐渐降低，酶解温度从60℃升高到65℃时，牡丹籽粕蛋白DH从17.25%降低到14.36%，结果见图1。

3.1.2 pH对牡丹籽粕蛋白酶解效果的影响

碱性蛋白酶的活性很大程度上取决于pH，因为pH能显著影响碱性蛋白酶活性位点的氨基酸电离状态，而且在维持酶的正常构象方面起着重要作用[11-12]。本试验中，随着酶解液pH从6.5增加到7.5，牡丹籽粕蛋白的DH从8.08%增大到19.53%，当pH值从7.5继续增加到8.0时，牡丹籽粕蛋白DH从19.53%显著降低到14.40%，结果见图2。

图1 不同酶解温度下牡丹籽粕的蛋白酶解度

图2 不同pH时牡丹籽粕的蛋白酶解度

3.1.3 酶浓度对牡丹籽粕蛋白酶解效果的影响

蛋白酶解时，底物浓度确定时，随着酶浓度的增加，水解度随着提高，当酶浓度超过一定量时，DH趋于平缓。本试验中，随着酶浓度从0.6%增加到1.0%，牡丹籽粕蛋白DH从12.58%增加到17.84%，当酶浓度从1.0%继续增加到1.2%时，牡丹籽粕蛋白DH从17.84%变为17.90%，结果见图3。

图3 不同酶浓度下牡丹籽粕蛋白的酶解度

3.1.4 反应时间对牡丹籽粕蛋白酶解效果的影响

本试验中，随着反应时间从1 h增大到3 h，牡丹籽粕蛋白DH从8.24%显著地增加到15.86%，再继续增加反应时间，牡丹籽粕蛋白DH趋于平稳，可能3 h的反应时间已经能够确保底物与酶充分反应，再继续延长反应时间，DH的变化幅度很小，结果见图4。

图4 不同反应时间时牡丹籽粕的蛋白酶解度

3.2 正交试验优化酶解工艺

结果见表2和表3。

表2 正交试验设计及牡丹籽粕蛋白DH测定结果

表3 牡丹籽粕蛋白DH方差分析结果

由表2、表3方差分析结果可知，温度、pH、酶浓度对牡丹籽粕蛋白水解度的影响差异极显著（P＜0.01），反应时间对牡丹籽粕蛋白水解度的影响差异显著（P＜0.05）；影响因素主次顺序为pH＞酶解温度＞酶浓度＞反应时间。最佳酶解工艺组合为pH=7.5、酶解温度60℃，酶浓度为1.2%，反应时间为3 h。

4 结 论

牡丹籽粕是压榨牡丹籽油的副产物，由于对牡丹籽粕的研究主要集中在其化学成分方面，因此大量榨油后的牡丹籽粕被废弃。研究表明，在肉鸡饲料中添加一定比例牡丹籽粕，能显著提高21 d肉鸡血浆IgG、IgM含量（P＜0.05）；在产蛋鸡饲料中添加5%牡丹籽粕能够提高蛋壳质量、蛋黄等级、蛋白高度、哈氏单位[13]。牡丹籽粕蛋白质含量为30%左右，且是一种营养健康安全的植物蛋白。小肽能够促进动物肠道系统的早期快速发育，对患有胃肠疾病动物的营养吸收、维护肠道健康、补充动物在快速生长期和高产期对氨基酸的需求具有重要意义[14]，将牡丹籽粕蛋白降解为更容易被吸收利用的小肽同时可解决适口性问题。本试验借鉴大豆肽的生产工艺，采用碱性蛋白酶直接酶解牡丹籽粕蛋白，制备牡丹籽粕小肽饲料。通过单因素试验和正交设计对影响牡丹籽粕蛋白酶解的因素进行考察，获得最佳工艺条件为：pH=7.5，酶解温度为60℃，酶浓度为1.2%，反应时间为3.0 h，牡丹籽粕蛋白水解度为17.18%。