基于TLR4/NF-κB/NLRP3通路的羟基红花黄色素A抑制血管紧张素II诱导的血管外膜成纤维细胞迁移研究

李伟慷，崔清卓#，郑玉光，张一昕，郭炳颜，赵京山,2,*，刘 琳

1.河北中医学院药学院，河北省中药炮制创新中心，河北 石家庄 050020

2.河北中医学院基础医学院，河北 石家庄 050020

3.河北省中药资源利用与质量评价国际联合研究中心，河北 石家庄 050020

4.河北医科大学第二附属医院，河北 石家庄 050020

动脉粥样硬化（atherosclerosis，AS）是冠心病、卒中、心肌梗死等多种心血管疾病的主要原因，也是造成全球人口死亡最主要的病因。AS 表现为细胞和富含脂质的斑块沉积于内膜下，浸润的白细胞和巨噬细胞促进血管炎症、斑块生长和破裂，最终导致动脉血栓形成，堵塞动脉血管。因此，传统理论认为AS 源于内皮损伤，是“由内到外”的反应过程。然而，支架置入或球囊血管成形术损伤内皮后，在新生内膜产生之前，血管外膜成纤维细胞（vascular adventitial fibroblasts，VAFs）早已开始增殖并迁移到内膜区域，分泌细胞外基质蛋白产生新生内膜[1]。近一半的新生内膜细胞来源于增殖的外膜成纤维细胞，表明动脉外膜参与血管重构反应。因此，越来越多的研究证实，AS 的发生发展可能是“由外而内”的过程[1]，构成外膜的VAFs 发挥着重要作用。中医对心血管疾病的研究在不断深入，吴以岭院士的脉络学说为心血管疾病的防治提供了理论依据，其核心理论为营卫承制调平。营气与血管内膜，卫气与血管外膜具有相关性。营行脉中，卫行脉外，卫外固护，阻邪于外，营卫调和，才能发挥血管舒缩功能；反之，“营卫不通，血凝不流。”心血管病在中医中归属“胸痹”的范畴，卫气失常是胸痹的始动因素，卫失固护，腠理疏松，痰瘀邪气入脉，久而脉积[2]，这与近年来医学对血管外膜的研究成果相一致。

炎症是AS 及其相关的心血管疾病的主要驱动因素，抑制炎症能够治疗AS。白细胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）的单克隆抗体canakinumab可降低患者心血管事件复发的风险[3]。NOD 样受体热蛋白结构域相关蛋白3（NOD-like receptor thermal protein domain associated protein 3，NLRP3）炎症小体由NLRP3、凋亡斑点样蛋白（apoptotic spot-like protein，ASC）及半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-1（cystein-asparate protease-1，Caspase-1）组成，ASC可以通过与pro Caspase-1 结合激活Caspase-1，进而促进IL-1β、IL-18 及下游炎症通路的激活[4]。Toll样受体4（Toll-like receptor 4，TLR4）及核因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）为NLRP3 炎性小体的上游分子。研究表明，TLR4/NF-κB/NLRP3 信号通路在心肌缺血/再灌注损伤及心肌损伤中发挥重要作用[5-6]。然而，TLR4/NF-κB/NLRP3 信号通路在血管重塑及AS 中对血管外膜的作用有待进一步研究。

心血管疾病在中医中统称为“胸痹”，常以活血化瘀药治疗。中医认为胸痹主要病位在心和血脉，血液浓稠、凝固，心脉瘀阻而“胸痹”，当以活血化瘀、宣痹通脉。红花是我国应用广泛的活血化瘀药，红花及其水提物常用于辅助治疗冠心病、脑梗死、冠状AS。羟基红花黄色素A（hydroxylsafflower yellow A，HSYA）是红花的主要活性成分，在心血管疾病中发挥重要保护作用[7-8]。研究发现，HSYA能够通过AMP 依赖的蛋白激酶（AMP-activated protein kinase，AMPK）/NF-κB/NLRP3 信号通路抑制支气管炎，从而减轻小鼠的哮喘症状[9]，还可通过抑制NLRP3 炎症小体激活保护心肌缺血/再灌注损伤[10]。课题组前期研究发现，HSYA 能够通过调控自噬抑制血管紧张素II（angiotensin II，ANG II）诱导的VAFs 迁移，改善血管重塑[11]。然而，HSYA在TLR4/NF-kB/NLRP3 信号通路中的作用目前尚未被研究。本研究主要探讨HSYA 是否通过调控TLR4/NF-kB/NLRP3 信号通路抑制ANG II诱导的VAFs 迁移，为HSYA 改善血管重塑及治疗AS 提供实验基础和理论依据。

1 材料

1.1 动物

SPF 级雄性SD 大鼠，体质量160～200 g，6 周龄，购自河北省实验动物中心，动物合格证号IP08169。动物饲养于河北中医学院动物房，遵循SPF级动物饲养条件，环境温度稳定为24 ℃，相对湿度为45%，通风，12 h/12 h 光照/黑暗交替，自由饮食。动物实验遵循实验动物护理原则，并经河北中医学院动物保护委员会批准（批准号DWLL202203044）。

1.2 药品与试剂

羟基红花黄色素A（批号2021100361，质量分数为99%）购自上海源叶生物科技有限公司；脂多糖（lipopolysaccharide，LPS，批号2022060581）、血管紧张素II（批号2022031156）购自北京索莱宝科技有限公司；DMEM/F12 培养基（批号2022011271）购自美国Gibco 公司；胎牛血清（fetal bovine serum，FBS，批号2021051623）购自杭州四季青生物科技有限公司；甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）兔抗大鼠抗体（批号2022061362）购自英国Abcam公司；α-平滑肌肌动蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）兔抗大鼠抗体（批号2022040511）、波形蛋白（Vimentin）兔抗大鼠抗体（批号CY5134）、NLRP3兔抗大鼠抗体（批号2022030316）、Caspase-1 兔抗大鼠抗体（批号202205187）、HRP 标记的IgG 二抗（批号2022040315）、山羊抗兔488 荧光二抗（批号2022032619）、山羊抗兔 594 荧光二抗（批号2022050106）购自上海泊湾生物科技有限公司；ASC兔抗大鼠抗体（批号2022020817）购自美国Affinity Biosciences 公司；TLR4 抗体、NF-κB 抗体、p-NFκB 抗体、核质蛋白提取试剂盒（批号2022180627）购自上海泊湾生物科技有限公司；CCK-8 试剂盒（批号2022060721）购自上海圣尔生物有限公司。

1.3 仪器

SW-CJ-2FD 型超净工作台（苏州安泰空气技术有限公司）；311 型细胞培养箱（美国Thermo Fisher Scientific 公司）；VICTOR Nivo 型多功能微孔读数仪（德国Perkln Elmer 公司）；ECLIPSE Ti2 型倒置相差显微镜、ECLIPSE TS2 型荧光显微镜（日本Nikon 公司）；5804 型高速离心机（德国Eppendorf公司）；1645050 型电泳、电转膜仪（美国Bio-Rad公司）；Fusion FX5 Spectra 型多功能成像系统（法国Vilber 公司）。

2 方法

2.1 原代VAFs 培养

大鼠ip 25%乌拉坦（10 mL/kg）麻醉，固定，75%乙醇消毒，打开胸腔，取出胸主动脉。PBS 清洗主动脉后，去除血管外膜周围的脂肪组织，纵切面剪开血管，清洗管腔，去除血管内皮细胞和中层平滑肌细胞，将剩余的血管外膜剪成小块（1 mm2/块），用含15%胎牛血清的完全培养基贴壁培养，置于37 ℃、5% CO2细胞培养箱中培养。

组织贴壁培养1 周后，用0.25%胰酶消化组织贴块周围的细胞，待细胞由梭形变圆时，去除胰酶，并用培养基终止消化过程。收集细胞悬液，1000 r/min 离心10 min，弃上清，获得P0 代VAFs。细胞按1∶3 传至P3 代，获得实验用VAFs。通过免疫荧光实验鉴定VAFs。

2.2 ANG II 及HSYA 的量效、时效关系确定

将细胞按3000 个/孔接种于96 孔板，待细胞处于对数生长期时，在无血清的培养基中培养12 h，然后添加100 μL 含不同浓度梯度的ANG II（0、1×10-5、1×10-6、1×10-7、1×10-8、1×10-9mol/L）或HSYA（0、5、10、20、40、80、160 μmol/L）的培养基刺激细胞，并设置对照组（无细胞培养基），细胞继续培养24 h，采用CCK-8 法检测细胞活力。确定ANG II及HSYA 作用浓度后，将细胞接种于96 孔板，接种密度和培养条件相同。细胞饥饿刺激后，将ANG II或HSYA 的作用时间设置为0、12、24、48 h，并设置对照组，采用倒序给药法对细胞给予ANG II或HSYA 刺激。最后一次给药即为0 h，给药结束后，CCK-8 法检测细胞活力，平行测定6次，实验重复3 次，取平均值。

2.3 CCK-8 法测定VAFs 活力

将对数生长期的细胞接种于96 孔板，待细胞稳定生长时，用无血清培养基培养12 h，给予ANG II或HSYA 刺激，每组设置6 个复孔，继续培养24 h，每孔加入10 μL CCK-8 试剂，37 ℃孵育1 h 后，酶标仪检测490 nm 处的吸光度（A）值，计算细胞活力。实验重复3 次。

2.4 Western blotting 检测ANG II 诱导的VAFs 中TLR4 和NF-κB 蛋白表达

VAFs 以2×105个/孔接种于6 孔板，待细胞对数生长后，设置对照组、ANG II组和HSYA（20、40、60 μmol/L）组，对照组给予培养基正常培养，其余各组给予1×10-7mol/L ANG II处理24 h 构建ANG II诱导的VAFs 迁移模型。然后更换为含不同浓度HSYA 的培养基，继续培养24 h。收集各组细胞，加入含蛋白酶抑制剂的RIPA 裂解液，提取细胞总蛋白，BCA 法测定蛋白浓度。蛋白样品经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳，转至PVDF 膜，用5%脱脂牛奶封闭2 h，加入一抗，4 ℃孵育过夜；加入二抗孵育后，利用化学发光法将蛋白印迹显色。

2.5 免疫荧光实验

VAFs 以1×104个/孔接种于放置无菌爬片的24孔板，培养48 h。设置对照组、ANG II组、HSYA 组、LPS 组和LPS＋HSYA 组，对照组给予培养基正常培养，其余各组给予1×10-7mol/L ANG II处理24 h 构建ANG II诱导的VAFs 迁移模型。然后更换为含100 nmol/L LPS 或40 μmol/L HSYA 的培养基，继续培养24 h。取出爬片，使用0.25% Triton X 100 打孔，滴加37 ℃山羊血清封闭30 min，滴加兔抗鼠NLRP3、Vimentin、α-SMA、ACS 抗体（1∶200），37 ℃封闭1 h；滴加山羊抗兔594 荧光二抗，避光封闭30 min，滴加DAPI封片，于荧光显微镜下观察并拍照。

2.6 划痕实验

VAFs 以2×105个/孔接种于6 孔板，待细胞对数生长，更换无血清培养基培养12 h 后，用无菌枪头在细胞上划线，按“2.5”项下方法分组，LPS 提前3 h 预处理细胞，再加入相应浓度的ANG II和HSYA。拍照记录给药0 h 细胞状态，更换为含15%胎牛血清的完全培养基，继续培养24 h，随机选取3 个划痕视野拍照记录24 h 细胞状态，计算细胞迁移率。

迁移率＝(0 h 划痕宽度－24 h 划痕宽度)/0 h 划痕宽度

2.7 统计学分析

采用Graphpad Prism 5 软件对实验数据进行统计分析，结果以±s表示，One-way ANOVA 用于多组比较分析，t检验用于两两比较分析。

3 结果

3.1 原代VAFs 的形态及鉴定

VAFs 形态为梭形，大鼠胸主动脉血管外膜组织贴块爬出的细胞形态符合VAFs（图1-A）。免疫荧光染色检测VAFs 的标志蛋白Vimentin 及血管平滑肌细胞的标志蛋白α-SMA，如图1-B所示，Vimentin呈阳性表达，未见α-SMA 表达，进一步证实VAFs培养成功。

图1 VAFs 形态(A，×100)及α-SMA、Vimentin 蛋白表达(B，×400)Fig.1 Morphology(A,× 100),α-SMA and Vimentin protein expressions(B,× 400)of VAFs

3.2 ANG II 的剂量及作用时间确定

利用CCK-8 法检测ANG II处理VAFs 后细胞活力的变化，确定ANG II的作用浓度和刺激时间。如图2所示，1×10-7mol/L ANG II促进细胞生长的作用最强（P＜0.01），因此，选用1×10-7mol/L 的ANG II进行后续实验。进一步的作用时效结果显示，ANG II的作用时效呈钟形，即细胞活力随着作用时间增加显著增强，24 h 作用最强（P＜0.01），24 h 后随时间延长细胞活力逐渐降低，因此后续ANG II作用时间选择24 h。

图2 ANG II 对VAFs 活力的量效(A)和时效(B)关系(±s,n = 6)Fig.2 Dose-effect(A)and time-dependent(B)of ANG Ⅱ on cell viability of VAFs(±s,n = 6)

3.3 HSYA 的剂量及作用时间确定

利用CCK-8 法检测HSYA 处理VAFs 后细胞活力的变化，确定HSYA 的作用浓度和刺激时间，如图3所示，HSYA 能够显著抑制VAFs 活力（P＜0.05、0.01），当作用浓度达到40 μmol/L，细胞抑制率达到50%，当作用浓度达到80 μmol/L 时，细胞出现萎缩。因此，选用40 μmol/L 的HSYA 进行后续实验。进一步的作用时效结果显示，随着HSYA 作用时间延长至24 h，细胞活力显著下降（P＜0.01）；继续延长至48 h，细胞活力下降50%，但出现皱缩，因此后续HSYA 作用时间选择24 h。

3.4 HSYA 抑制TLR4/NF-κB 信号通路

如图4所示，与对照组比较，ANG II组TLR4蛋白表达水平显著升高（P＜0.001），p-NF-κB 和核内NF-κB 蛋白表达水平均显著升高（P＜0.05、0.001）；与ANG II组比较，HSYA 组TLR4 蛋白表达水平显著降低（P＜0.01、0.001），HSYA（40、60 μmol/L）组p-NF-κB 蛋白表达水平显著降低（P＜0.05），HSYA 各剂量组核内NF-κB 蛋白表达水平显著降低（P＜0.05、0.01、0.001），表明HSYA 能够抑制TLR4/NF-κB 信号通路，并且可以抑制NF-κB的磷酸化和入核。

图4 HYSA 抑制ANG II 诱导的VAFs 中TLR4、NF-κB 和p-NF-κB 蛋白表达(±s,n = 4)Fig.4 HSYA inhibited the expression of TLR4,NF-κB and p-NF-κB protein expressions(±s,n = 4)

3.5 HSYA 抑制NLRP3 和ASC 共表达

如图5所示，与对照组比较，ANG II组NLRP3和ASC 荧光强度增加，NLRP3 和ASC 共表达增加，提示ANG II促进NLRP3 炎性小体激活和组装。与ANG II组比较，HSYA 组NLRP3 和ASC 荧光强度减弱，NLRP3 和ASC 共表达减少，表明HSYA 能够抑制NLRP3 炎性小体的组装和激活。

图5 HSYA 抑制NLRP3 和ASC 共表达(×400)Fig.5 HSYA inhibited the co-expression of NLRP3 and ASC(× 400)

3.6 HSYA 抑制ANG II 及LPS 诱导的VAFs 迁移

LPS 能够激活TLR4/NF-κB 信号通路，课题组前期研究发现HSYA 能够抑制ANG II诱导的VAFs的迁移[11]。为了确定HSYA 抑制VAFs 的迁移作用与TLR4/NF-κB 有关，在ANG II诱导的VAFs 迁移模型上对细胞进行LPS 刺激，通过划痕实验检测细胞迁移情况，如图6所示，与对照组比较，ANG II组细胞迁移率显著增加（P＜0.01）；与ANG II组比较，HSYA 组细胞迁移率显著降低（P＜0.01），LPS组细胞细胞迁移率增加；与LPS 组比较，LPS＋HSYA 组细胞迁移率显著降低（P＜0.01），表明HSYA 能够逆转LPS 对VAFs 迁移的促进作用。

图6 HSYA 对LPS 诱导的VAFs 迁移的作用(×40，±s,n = 4)Fig.6 Effect of HSYA on LPS-induced VAFs migration(× 40,±s,n = 4)

3.7 HSYA 抑制LPS 诱导的VAFs 中NLRP3 和ASC 共表达

为了进一步确定HSYA 可通过调控TLR4/NFκB 通路抑制NLRP3炎症小体的激活，检测LPS 刺激的VAFs 细胞中NLRP3 炎症小体相关蛋白的共表达。如图7所示，与对照组比较，ANG II组NLRP3和ASC 蛋白共表达增加；与ANG II组比较，HSYA组NLRP3 和ASC 蛋白共表达降低，LPS 组NLRP3和ASC 蛋白共表达增加；与LPS 组比较，LPS＋HSYA 组NLRP3 和ASC 蛋白共表达降低，HSYA逆转了LPS 对VAFs 中Caspase-1 和ASC 的共表达，表明HSYA 靶向抑制NLRP3 炎性小体组装。LPS 为TLR4/NF-κB 通路及NLRP3炎症小体的激活的上游刺激物质，能够激活TLR4/NF-κB/NLRP3信号通路，HSYA 能够抑制LPS 刺激的NLRP3炎症小体的组装及VAFs 的迁移。以上结果表明HSYA通过抑制TLR4/NF-κB/NLRP3 通路抑制LPS 诱导NLRP3 炎性小体激活。

图7 HSYA 对LPS 诱导的NLRP3 和ASC 共表达的作用(×40)Fig.7 Effect of HSYA on LPS-induced co-expression of NLRP3 and ASC(× 40)

4 讨论

动脉血管由以内皮细胞为主的内膜、以血管平滑肌细胞为主的中膜以及富含胶原纤维的外膜组成。内皮细胞和血管平滑肌细胞已受到血管生物学家的广泛关注，而构成外膜的主要细胞类型——外膜成纤维细胞在很大程度上被忽视。然而，越来越多的实验数据表明，血管外膜在AS 和高血压等血管疾病中发挥关键调节作用[12-13]。外膜作为血管壁的主要“损伤感知组织”，在内膜发生改变之前，VAFs 早已对缺氧、血管膨胀、损伤及炎症等环境压力做出反应，表现为VAFs 激活、增殖并迁移至内膜和中膜，进而导致血管重构[14]。另外，迁移的VAFs能够增加细胞因子的分泌，直接影响血管平滑肌细胞张力，促进血管炎症发生，从而影响整个血管张力和血管壁结构[15-16]。因此，VAFs 能够“由外而内”调节血管的功能和结构。抑制VAFs 的迁移，能够改善血管纤维化、AS 及其相关的心血管疾病。

心血管疾病在中医中属“脉络-系统性疾病”，从《络病学》的“络病证治”到《脉络论》的“络脉学说”，其核心理论为营卫承制调平。卫气失常，卫外不固，腠理疏松，痰浊瘀血邪气易侵，久则脉积，易发中风、胸痹等。脉积与西医中AS 相关，是心血管疾病的发病基础。血管外膜护卫不利，外膜滋养血管增多，招募炎症细胞[17]，促进成纤维细胞活化，发生表型转化，向内膜迁移，造成内膜增生增厚[18]，导致血液瘀阻，从而促进心血管疾病的发生发展。中医卫营调平与血管外内膜稳态具有相关性，固卫外，消瘀堵，在疾病早期抑制血管外膜重构或可成为潜在治疗靶点。

持续的炎症免疫反应在动脉硬化不稳定斑块的形成、发展和破裂过程中发挥重要作用。TLR4 是一种跨膜转导受体，能够与LPS 结合，NF-κB 及其转录调控的各种炎性细胞因子，在AS 的发展过程中发挥关键作用[19]。抑制TLR4/NF-κB 通路可减轻AS[20]。因此，TLR4/NF-κB 通路在LPS 感染中起重要作用。除TLR4/NF-κB 通路外，NLRP3炎症小体的激活在AS 的发展过程发挥重要作用[21]。NLRP3可调节IL-1β 和IL-18 的生成，参与炎症介导的斑块的形成与发展[21]。因此TLR4、NF-κB、NLRP3 炎症小体是AS 等炎症性疾病的有前景的药理靶点。

红花是经典的活血化瘀药，常用于治疗多种心脑血管疾病。HSYA 为红花最主要的有效成分，在多种疾病中发挥重要作用[7-8]。研究表明，HSYA 可通过抑制炎症减轻小鼠的哮喘症状[9]，HSYA 还可通过蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）信号通路抑制内皮损伤及血管平滑肌细胞的迁移减轻AS[22-23]。然而，HSYA 能否通过抑制TLR4/NF-κB/NLRP3 通路抑制ANG II诱导的VAFs 的迁移，改善血管重构，目前尚未被研究。本研究利用ANG II诱导VAFs的增殖和迁移，并给予细胞LPS 刺激，探究HSYA在LPS 诱导的TLR4/NF-κB/NLRP3 炎症通路中的作用。通过免疫荧光实验鉴定大鼠主动脉组织贴块法培养的细胞为VAFs。ANG II及HSYA 的量效、时效结果确定ANG II和HSYA 的最佳作用浓度分别为1×10-7mol/L 和40 µmol/L，作用时间均为24 h。Western blotting 结果显示，ANG II刺激显著增加VAFs 中TLR4 及NF-κB 的磷酸化水平，还能升高核内NF-κB 含量；HSYA 能够显著抑制ANG II诱导的TLR4 及NF-κB 的磷酸化水平升高，抑制效果与作用浓度正相关。NLRP3 炎性小体的激活在血管重塑中发挥重要作用，为了明确HSYA 对ANG II诱导的VAFs 迁移的抑制作用与NLRP3 炎症小体有关，检测细胞中NLRP3炎症小体的组装情况，结果显示，与对照组比较，ANG II组细胞中NLRP3和ASC 荧光重合后，荧光强度增加，提示ANG II促进NLRP3 和ASC 的共表达，以上结果表明，ANG II促进NLRP3 炎性小体组装。与ANG II组比较，随着HSYA 剂量增加，VAFs 中NLRP3 和ASC 的共表达逐渐降低，表明ANG II诱导的VAFs 中NLRP3炎性小体的激活被HSYA 显著抑制。划痕实验结果表明，HSYA 能够显著抑制ANG II及LPS 诱导的VAFs 迁移。LPS 为NLRP3 炎性小体的上游，能够激活NLRP3 炎性小体[24]。对细胞进行LPS 刺激，检测HSYA 对LPS 诱导的NLRP3 炎性小体激活的作用。采用免疫荧光双染实验同时检测ASC 和NLRP3 蛋白，免疫荧光结果显示LPS 诱导ASC 和NLRP3 共表达增加，提示LPS 促进NLRP3 炎性小体的组装，而HSYA 逆转了这一作用，表明HSYA 通过抑制NLRP3 炎性小体的组装和激活抑制ANG II诱导的VAFs 迁移。

无菌性炎症在早期和晚期AS 的发展中起着重要作用[25]。TLR4 信号参与AS 的进展[20]，NLRP3炎性小体激活pro Caspase-1 的切割，促进炎症细胞因子的IL-1β 成熟与释放，加剧血管重构。VAFs 作为血管损伤响应的前哨细胞，启动并参与AS 相关的血管重构。因此，进一步探究HSYA 对ANG II诱导的TLR4/NF-κB 通路及NLRP3 炎性小体组装的影响。发现ANG II刺激能够激活TLR4/NF-κB 通路，促进NF-κB 的磷酸化与入核、NLRP3 炎性小体的组装，从而激活TLR4/NF-κB/NLPR3 通路的炎症反应；HSYA 能够抑制LPS 诱导的NLRP3 炎性小体组装及VAFs 的迁移和增殖，进而抑制血管重塑及其相关的心血管疾病。以上结果表明TLR4/NFκB/NLPR3 通路在VAFs 迁移和表型转化中起重要作用，进一步证实了HSYA 通过影响TLR4/NFκB/NLPR3 通路，抑制ANG II诱导的VAFs 迁移。

本研究发现，HSYA 能够通过 TLR4/NFκB/NLPR3 信号通路抑制ANG II诱导的VAFs 迁移。然而，HSYA 具有半衰期短、体内消除速度、口服生物利用度较低的特点[26-27]。HSYA 在体内是否能够显著改善ANG II诱导的血管重塑，需要进一步的动物实验来验证。另外，HSYA 在临床上常以血必净注射液或丹红注射液等复方制剂形式用药。因此，在研究HSYA 调控VAFs 迁移相关的血管重塑的作用机制的基础上，还应结合HSYA 在体内的代谢方式，选择合适的药用辅料，延长药物在体内的半衰期，为其临床治疗血管重塑性疾病提供实验基础依据。综上，HSYA 通过抑制TLR4/NFκB/NLPR3 通路抑制ANG II诱导的VAFs 迁移，改善血管重塑。HSYA 可能是治疗血管重塑性疾病的一个潜在的治疗候选药物。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突