中度嗜盐菌Halomonas salifodinae N35-6产四氢嘧啶的培养基优化

林 青,秦新政,高 雁,曾 军,娄 恺,时红玲,霍向东

(新疆农业科学院微生物应用研究所/新疆特殊环境微生物实验室,乌鲁木齐 830091)

0 引 言

【研究意义】四氢嘧啶是中度嗜盐细菌中主要的渗透压补偿溶质,能够作为稳定剂保护和稳定酶、细胞等抵抗高盐、干燥、冷冻、高温等逆境,起到抗逆协助作用。在制药、食品、生物制剂、酶制剂、农业和化学合成药物、农药等领域具有较大的应用价值[1]。但是,由于四氢嘧啶含有一个手性碳原子,很难用化学方法合成。目前四氢嘧啶主要还是利用微生物发酵法生产,但由于产量低,成本高,制约了其推广应用,因此利用微生物发酵提高四氢嘧啶的产率受到较多关注[2]。【前人研究进展】Galinski[3]在嗜盐外硫红螺菌中发现了环状氨基酸结构的四氢嘧啶。后续又发现在嗜盐的Halomonas、Chromohalobacter、Vibrio、Pseudomonas、Marinobacter、Brevibacterium、Streptomyces、Bacillus、Virgibacillus、Salibacillus、Halobacillus等属微生物中也能产生四氢嘧啶[4]。国外利用H.elongata菌种以“细菌泌乳法”已经实现四氢嘧啶的商业化生产[5]。Van-Thuoc 等[6]利用H.boliviensis,以两步补料-分批发酵法使四氢嘧啶的产量达到了 9.1 g/(L·d)。Zhang 等[7]利用外泌型的H.salina分批发酵使四氢嘧啶的产量达到了 7.9 g/(L·d),该方法的优点是菌株在相对较低的盐浓度下就能将产物外泌到发酵液中,降低了高盐对菌种生长的抑制和对设备的腐蚀。Chen等[8]通过优化培养基与搅拌转速,中度嗜盐菌H.salinaBCRC17875的四氢嘧啶产量达到13.96 g/L。Ning等[9]构建的大肠杆菌基因工程菌株ECT05,采用流加发酵工艺,四氢嘧啶产量最高达25.1 g/L。Perez-Garcia[10]构建谷氨酸棒杆菌基因工程菌,四氢嘧啶产量最高达22 g/L。Li等[11]通过基因改造H.hydrothermalisY2,四氢嘧啶产量达到11.5 g/L,其中67%外泌到培养基中。Jiang[12]构建的目前四氢嘧啶产量最高的谷氨酸棒杆菌基因工程菌CB5L6,四氢嘧啶产量达到了45.52 g/L。【本研究切入点】目前许多研究者仍在发掘新的四氢嘧啶产生菌,但新疆耐盐微生物资源的相关研究还很少报道。需进行中度嗜盐菌HalomonassalifodinaeN35-6产四氢嘧啶的培养基优化。【拟解决的关键问题】挖掘产四氢嘧啶的新疆耐盐微生物资源, 研究其生产性能, 为新疆耐盐微生物资源的利用和开发提供支撑。

1 材料与方法

1.1 材 料

采样地点:新疆哈密七角井盐湖(43°25′N, 71°30′E)。

分离培养基:R2A培养基(含3%、5%、10%、15%、20% NaCl) 和NA培养基(含3%、5%、10%、15%、20% NaCl)。

种子培养基(g/L): L-谷氨酸钠10, KH2PO43, K2HPO4·3H2O 11.8, MgSO4·7H2O 0.4, MnSO4·H2O 0.01, FeCl20.05,酵母粉 5,葡萄糖 10,NaCl 30, pH 7.2。

发酵培养基(g/L): KH2PO43, K2HPO4·3H2O 11.8, MgSO4·7H2O 0.4, MnSO4·H2O 0.01, FeCl20.05,(酵母粉、L-谷氨酸钠 、NH4Cl、葡萄糖 、NaCl 试验设计添加量),pH 7.2。

1.2 方 法

1.2.1 耐盐菌的分离

取1 g土样稀释至105,取100 μL涂布于分离培养基,30℃培养72 h后,挑取培养基上生长的单菌落保存。

1.2.2 分子鉴定

采用细菌通用引物:27F 5′-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3′与1 492R 5′-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3′。PCR扩增反应体系:上下游引物(50 pmol/μL)各0.5 μL,2×PCR mix(含Taq酶1.25 U/25 μL) 25 μL,模板DNA 2 μL,无菌ddH2O补足50 μL,阴性对照为不加模板DNA。PCR条件:94℃ 4 min;94℃ 1 min,55℃ 1 min,72℃ 2 min,30个循环;72℃10 min。PCR产物由北京新时代众合科技生物公司测序。

1.2.3 发酵培养基的响应面优化

优化酵母粉、L-谷氨酸钠(MSG)、NH4Cl、葡萄糖、NaCl的添加量对四氢嘧啶产量的影响。菌株接种于装有1 mL种子培养液的96孔深孔板,150 r/min,30℃培养48 h,5 000 r/min离心5 min,去除上清,加入1 mL发酵培养液,继续培养48 h,5 000 r/min,10 min离心收集菌体,加1 mL 80%乙醇振荡重悬,静置过夜,10 000 r/min,10 min离心取上清。表1

1.2.4 四氢嘧啶的检测

HPLC(Agilent 1260),液相色谱柱为Welch Ultimate Polar-RP(4.6 mm×250 mm,5 μm)及配套保护柱;进样量20 μL,流动相为100%H2O,流速1 mL/min,柱温30℃,紫外波长210 nm检测四氢嘧啶的含量。

表1 因子水平编码

1.3 数据处理

利用Minitab18软件采用Box-behnken设计实验、分析数据。

2 结果与分析

2.1 16S rDNA 序列的同源性比较及系统发育树

研究表明,以菌株N35-6基因组DNA为模版,采用细菌通用引物进行PCR扩增,得到1 416 bp的PCR产物。菌株N35-6的16S rDNA序列GenBank登录号(OP143846)。N35-6菌株与H.salifodinaeBC7菌株(EF527873)的核苷酸序列同源性达99.15%。菌株N35-6与H.salifodinaeBC7菌株(AB245343)聚为一簇,与菌株N35-6的亲缘关系最近,确定该菌株为H.salifodinaeN35-6。图1

2.2 回归方程建立与变量影响

研究表明,酵母粉(X1)、L-谷氨酸钠(X2)、NH4Cl(X3)、葡萄糖(X4)、NaCl(X5)等5个因子与四氢嘧啶产量间的数学模型方程如下:

Y=0.740 + 0.049 4X1- 0.007 91X2- 0.024 2X3- 0.006 93X5- 0.007 17X4- 0.001 196X1×X1+ 0.000 004X2×X2+ 0.000 259X3×X3+ 0.000 013X5×X5- 0.000 095X4×X4- 0.000 810X1×X2- 0.000 946X1×X3+ 0.000 192X1×X5+ 0.000 712X1×X4+ 0.000 470X2×X3+ 0.000 060X2×X5+ 0.000 106X2×X4+ 0.000 113X3×X5- 0.000 043X3×X4+ 0.000 040X5×X4(R2=0.838 7)。

图1 菌株Halomonas salifodinae N35-6系统进化树

图2 因子影响四氢嘧啶产量的pareto 图Fig.2 Pareto chart evaluates the variables affecting ectoine production

2.3 因子间交互效应对四氢嘧啶产量的影响

研究表明,随着酵母粉、NaCl、葡萄糖浓度的增加,四氢嘧啶产量呈逐渐增加的趋势,但随着L-谷氨酸钠、NH4Cl浓度的增加,四氢嘧啶产量呈逐渐降低的趋势。酵母粉、L-谷氨酸钠、NH4Cl、葡萄糖、NaCl等5个因子间的交互作用对四氢嘧啶产量没有显著影响(α=0.05)。图3

2.4 四氢嘧啶产生最佳培养基的优化和验证

研究表明,得到最优培养条件为酵母粉 15 g/L、L-谷氨酸钠 10 g/L、NH4Cl 2 g/L、葡萄糖 40 g/L、NaCl 150 g/L。在最优条件下,通过发酵验证,得到四氢嘧啶产量平均值为0.83 g/L,与预测值1.02 g/L相近。模型预测可靠。

3 讨 论

3.1四氢嘧啶作为相容性溶质,可在嗜盐菌或耐盐菌胞内大量积聚,是微生物适应高盐、高渗透压和紫外辐射等环境,维持其在逆境中的正常生长,具有细胞和生物大分子保护作用[13-15]。四氢嘧啶的相关研究包括新菌株的筛选、已有菌株的基因工程改造、培养基和发酵工艺的优化[1]。已有研究表明氯化钠、酵母粉、L-谷氨酸钠、铵盐是影响耐盐、嗜盐微生物生长及胞内四氢嘧啶积累的培养基关键成分[16-18]。

3.2试验优化结果表明培养基中酵母粉是影响H.salifodinaeN35-6四氢嘧啶产量的最显著因子,酵母粉浓度15 g/L时,四氢嘧啶产量最高,与Wei等[19]酵母粉促进Marinococcussp.ECT1四氢嘧啶积累的结果一致。培养基中的NaCl显著影响H.salifodinaeN35-6四氢嘧啶的产量,这与NaCl显著影响耐盐菌、嗜盐菌中四氢嘧啶的积累结果一致[6,20],NaCl浓度150 g/L时,H.salifodinaeN35-6四氢嘧啶的产量最高。培养基中的铵盐对H.salifodinaeN35-6四氢嘧啶的产量影响显著,合适的铵盐浓度有利于四氢嘧啶的积累[8,17,21,22]。但与已有结果不同,研究中L-谷氨酸钠对四氢嘧啶的产量影响不显著。利用H.salifodinaeN35-6生产四氢嘧啶的发酵工艺还需进一步优化。

表2 响应面二次模型的方差

4 结 论

分离到一株能够产四氢嘧啶的细菌菌株N35-6,其亲缘关系与H.salifodinae菌株 BC7最近,确定菌株N35-6属于H.salifodinae。菌株N35-6四氢嘧啶产量可达0.83 g/L。菌株中度嗜盐菌H.salifodinaeN35-6具有高产四氢嘧啶的潜力。

图3 Ectoine 产量影响因子交互作用曲面图Fig.3 Interactions plots of variables affecting ectoine production