马铃薯病毒病病原RT-PCR分子鉴定

杨茹薇,刘 易,李江涛,古丽米拉·热合木土拉,罗正乾,徐琳黎,沈洪飞

(新疆农业科学院综合试验场,乌鲁木齐 830012)

0 引 言

【研究意义】马铃薯(SolanumtuberosumL)是茄科茄属的一年生草本块茎植物,其块茎可供食用[1]。马铃薯是粮食、蔬菜兼用作物,在动物饲料工业酿酒、提取淀粉、种薯及各种加工产品中应用广泛。目前世界上马铃薯的种植面积和产量仅次于小麦、水稻和玉米,在粮食作物中位居第4。马铃薯病毒病是影响马铃薯生产的主要病害之一,在世界各国马铃薯种植区均有分布,其流行较广,危害性较大,导致马铃薯的产量下降和质量变劣,一般可减产20%～50%,严重时减产可达80%以上[2]。蚜虫传播、接触传播和摩擦传播是马铃薯病毒病的主要传播途径[3、4]。【前人研究进展】Zang等[5]利用酶联免疫吸附原理结合传感器介绍了检测烟草花叶病毒的新方法。多重RT-PCR在病毒检测中得到了广泛的推广和应用[6]。Feng等[7]运用实时定量PCR技术检测出黄瓜花叶病毒,并建立了方程进行数据分析。聂峰杰等[8]应用RT-PCR技术对宁夏马铃薯脱毒种薯进行了病毒检测。沈林林等[9]采用多基因联合方法对福清产区马铃薯Y病毒株系组成进行鉴定。【本研究切入点】目前,我国内蒙古、黑龙江、山东等地已有马铃薯病毒病分子鉴定的报道[10-18]。需应用RT-PCR分子鉴定技术进行马铃薯病毒病病原种类的鉴定,分析我国新疆马铃薯主产区病毒病害的发生情况。【拟解决的关键问题】采集我国新疆主产区马铃薯病毒样本,完成阳性样本的序列比对及分析,为有针对性综合防控我国新疆主产区病毒病提供重要依据。

1 材料与方法

1.1 材 料

于2021年在我国新疆马铃薯主产区乌鲁木齐县、吉木萨尔县、奇台县、巴里坤县、泽普县,共87份样本,对其编号后放置于-80℃冰箱保存备用。表1

表1 病毒病采样点

1.2 方 法

1.2.1 总RNA提取及RT-PCR检测

按照提取试剂盒将马铃薯叶片RNA提取后,将总RNA反转合成为cDNA,以cDNA为模板进行病毒的RT-PCR检测。PCR 反应体系均为:2×easyTaqsuper Mix 10 μL、正反向引物各0.5 μL(10 mmol / L)、cDNA 1 μL、ddH2O补足至20 μL。反应程序:95℃ 5 min;95℃ 30 s,55℃ 30 s,72℃ 40 s,35 个循环;72℃ 7 min,4℃保存[19]。反应完毕后,取7 μL PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测扩增结果。在120V恒压条件下电泳25 min后,在凝胶成像系统上查看结果并保存。

1.2.2 测序

将扩增出的特异性条带进行测序,得到的CP基因序列在NCBI网站中比对分析,选取NCBI上发布的分离物的CP基因完整序列。利用MEGA 7.0软件的Clustal W法进行多序列比对分析以及邻接法(neighbor joining,NJ)构建系统进化树,系统进化树中各分支置信度(bootsrap)进行1 000次重复分析。表2

2 结果与分析

2.1 马铃薯感染病毒的症状

研究表明,在我国新疆乌鲁木齐县、奇台县、吉木萨尔县、巴里坤县、泽普县等主产区进行采样,马铃薯植株症状表现有矮化、花叶、卷叶等症状,病株叶片褪绿黄化,叶片边缘有轻微内卷,叶片变脆增厚。图1

表2 检测5种病毒引物序列

图1 马铃薯感染病毒后的症状Fig.1 Symptoms of a potato infected with a virus

2.2 病毒检出率

研究表明,对87份样本进行提取总RNA后,获得cDNA,以cDNA为模板,用引物-F和-R进行PCR扩增。从87份样本检测出PVY、PVS、PLRV,其检出率分别为100%、37.93%、6.89%,未检出PVX、PVM病毒,其中4个样本为PVY、PVS、PLRV三种病毒复合侵染,29个样本为PVY、PVS两种病毒复合侵染,1个样本为PVY、PLRV两种病毒复合侵染。表3

采集样本均出现PVY特异性扩增条带,鉴定为均带PVY病毒。采用PVS特异性引物检测出33份带毒样本;采用PLRV特异性引物检测出6份带毒样本,分别为QT-9、QT-12、QT-13、QT-17、QT-20、QT-21,阴性样本未扩增到相应的片段。表3,图2

表3 马铃薯病毒RT-PCR检出统计

图2 马铃薯病毒RT-PCR电泳结果Fig.2 Results of RT-PCR electrophoresis of potato virus

2.3 PVY基因序列比对及进化树

研究表明,从87份阳性样本中获得CP基因与NCBI上来自中国23份,法国2份,美国4份,埃及1份,哈萨克斯坦2份,斯洛伐克2份,南非1份,叙利亚1份,斯洛文尼亚1份,俄罗斯1份,波兰4份,德国1份,共计43份,其中ZP-8、QT-21、JMS-43、QT-50、BLK-75号样本CP基因序列与中国福建(KJ634023.1)、中国山东(EF592525)、波兰(JF927762.1)、中国江苏(MN734254)序列一致性达到100%,与其他国家的分离物的一致性达到99.04%以上。表4

表4 用于序列比对及进化的PVY基因序列

利用采集到的43个PVY分离物构建进化树,以马铃薯A病毒(PVA)分离物NC004039作为外参,39个PVY分离物聚在两个大的分支上,其中比较大的一个分支,ZP-3、BLK-74、ZP-8、QT-12聚在一个分支上;QT-16,QT-33聚类在另一个分支上,QT-27、ZP-6、JMS-40、JMS-41离上述两个分支亲缘关系较远,根据进化树显示JMS-40和JMS-41的亲缘关系最近,外类群NC004039离上述的43个分离物的关系最远。图3

2.4 PVS基因序列比对及进化树

研究表明,从阳性样本中获得CP基因与NCBI上来自中国4份,苏格兰1份,匈牙利1份,俄罗斯2份,卢旺达1份,美国1份,伊朗1份,加拿大1份,共计12份PVS的cp基因序列进行同源性分析。其中ZP-2、ZP-7、QT-14、QT-15样本CP基因序列与中国广西(KF011279.1)、中国北京(MK387318.1)、中国山西(KC818635.1)、中国山西(KC818634.1)序列一致性达到97.59%以上,与其他国家的分离物的一致性达到96.1%以上。表5

图3 在PVY测序序列基础上构建的进化树Fig.3 Evolutionary tree constructed on the basis of PVY sequencing sequences

表5 用于序列比对及进化分析的PVS基因序列

以马铃薯P病毒(PVP)分离物EU338239作为外参,利用采集到的12个PVS分离物构建进化树,结果表明12个分离物中的9个可以清晰的分成2个主要的分支,QT-9、QT-12、QT-10、ZP-8、QT-11、QT-13分成一个分支,其中的QT-9、QT-12亲缘关系最近,ZP-2、ZP-7、QT-14分成一个分支,ZP-7、QT-14亲缘关系相对较近,QT-16、QT-15、ZP-6相对其他9个分离物亲缘关系较远,而ZP-6离其他11个分离物关系最远。图4

2.5 PLRV基因序列比对及进化树

研究表明,从6份阳性样本中获得CP基因与NCBI上来自中国4份,坦桑尼亚1份,法国1份共计6份PLRV的CP基因序列进行同源性分析。其中QT-12样本CP基因与坦桑尼亚(KC866618)序列一致性达到100%,QT-9、QT-17、QT-20、QT-21样本CP基因序列与中国广东(MF062487.1)、中国内蒙古(FJ859025)、中国河北石家庄(DQ315385)、中国内蒙古(KC456052)序列一致性达到99.06%,与法国的分离物的一致性达到99.62%以上。表6,图5

图4 在PVS测序序列基础上构建进化树Fig.4 Evolutionary tree constructed on the basis of PVS sequencing sequences

表 6 用于序列比对及进化分析的PLRV基因序列

QT-12、QT-13、QT-17、QT-20聚在一个分支上,其中QT-12、QT-13亲缘关系较近,QT-9在这些分离物中亲缘关系最远。图5

图5 在PLRV测序序列基础上 构建的进化树

3 讨 论

3.1研究新疆马铃薯主产区5个县疑似马铃薯病毒病样本,应用RT-PCR技术进行病毒病原鉴定,并对阳性样本CP基因进行序列比对分析,结果表明,在自然环境中,PVY是危害该区域马铃薯样本的主要病毒病原,一种或多种病毒的复合侵染马铃薯植株情况较为普遍,两种及两种以上病毒复合侵染可诱发比单一病毒更加严重的症状[20],由于马铃薯病毒病没有有效的防治药剂,需加强监管种薯生产中的病毒检测及鉴定,依靠准确高效的检测技术和手段来保证种薯质量[21]。

近年来国内外已报道的侵染马铃薯的病毒及类病毒超过40种,其中危害我国主要病毒病有PVY、PVX、PVS、PVM、PLRV、PVA,研究主要发现危害中国新疆的三种病毒病,与前期研究结果一致。胡新喜、范国权等[22-23]对我国四川省、湖南省、河北等地马铃薯病毒病进行鉴定研究,得出PVS检出率最高,与此次研究PVY检出率最高不相同,可见我国不同省(市、区)马铃薯病毒感染情况各不相同。

3.2目前,植物病毒病的检测方法主要包括形态学方法、免疫学方法、分子生物学(核酸分子杂交技术、聚合酶链式反应技术、环介导等温扩增技术)及纳米生物传感器技术等。病毒病防治技术从农业措施、抗病育种(茎尖脱毒繁育无病毒苗、植物病毒基因工程)、化学药剂防治(植物病毒天然抑制剂、化学合成抑制剂)、弱毒疫苗接种等技术,测序(NGS)技术也在记录和描述新型病毒和类病毒方面越来越流行[24-26]。

今后将计划扩大病样采集工作,开展小RNA深度测序及荧光定量PCR技术对感病植株携带病毒量进行定量分析,进一步阐明新疆马铃薯病毒病的分布情况。

4 结 论

4.1对87份样本进行反转录聚合酶链式反应检测,结果共检测出PVY、PVS、PLRV,其中4个样本为PVY、PVS、PLRV三种病毒复合侵染,29个样本为PVY、PVS两种病毒复合侵染。

4.2选出阳性样本作为PCR扩增产物,PVY的CP核酸序列与中国福建(KJ634023.1)、中国山东(EF592525)、中国江苏(MN734254)序列一致性达到100%,高于中国山西、宁夏、河南、吉林等地,ZP-2样本PVS的CP核酸序列与中国广西(KF011279.1)序列一致性达99.47%,中国新疆马铃薯主产县的PVY及PVS病毒可能来自国内某个病毒病发生区。QT-12、QT-13样本PLRV的CP核酸序列与坦桑尼亚(KC866618)序列一致性达到100%。中国新疆奇台马铃薯疑似病毒病植株出现的黄化、卷叶症状,是由PVY、PVS、PLRV三种病毒复合侵染所致,其余主产区未发现三种病毒复合侵染情况。