三种昆虫病原线虫非生物胁迫耐受特性及其共生菌抑菌作用

陈 澄,侯新强,詹发强, ,杨 蓉,包慧芳,王 宁,史应武,龙宣杞

(1.新疆大学生命科学与技术学院,乌鲁木齐 830046;2.新疆农业科学院微生物应用研究所/新疆特殊环境微生物重点实验室,乌鲁木齐 830091)

0 引 言

【研究意义】昆虫病原线虫具有对人畜环境无害、杀虫范围广、可主动搜寻寄主等特征,能够感染和杀死土栖性和钻蛀类害虫,具有较好的防效,是一种良好的生物杀虫剂[1-3]。昆虫病原线虫及其共生菌协同作用于害虫,导致害虫种群迅速死亡,这种快速的死亡率在所有昆虫目的一系列宿主中都能观察到[4],使其成为开发有效生防剂的最合适的候选者。【前人研究进展】昆虫病原线虫是一种专性寄生昆虫并且体内携带有共生细菌的体型微小的线虫[5-6],包括斯氏线虫属(Steinernema)和异小杆线虫属(Heterorhabditis)两类,分别与嗜线虫致病杆菌属(Xnowhabdus)和发光杆菌属(Photorhabdus)细菌有互惠互利的关系,它们通常被称为线虫-细菌复合体[7]。Glazer[8]、Liu 等[9]对嗜菌异小杆线虫(Heterorhabditisbacteriophora)进行了耐干燥能力和生理生化机制的研究,Chung 等[10]对其进行了致病力和繁殖力受侵染温度及剂量影响的报道,Dutky[11]观察到共生菌具有广谱性抗菌能力。已经报道的共生菌对多种植物病原菌以及人的病原菌具有一定的抑制作用,不同种共生菌所具有的抑菌活性有所差异,杨秀芬等[12]对嗜线虫致病杆菌代谢物对病原菌的抑制作用及稳定性进行了研究,嗜线虫致病杆菌对病原菌具有较好的抑制作用。【本研究切入点】土壤中的各种非生物(即温度、水分、土壤质地、土壤盐度、紫外线、氧气和pH)和生物(即天敌、杂食性动物、食腐动物、竞争对手和植物)因素都会影响侵染期线虫的生存[13]。昆虫病原线虫具有一定的寄主特异性,所以不同种、不同品系会对同一寄主昆虫产生不同的防治效果,相同的种或品系对不同的寄主昆虫防效也不相同[14]。土壤的温度和盐浓度影响线虫的生长、发育和繁殖,存活和侵染能力[15],同时会影响共生菌的增殖[16]。昆虫病原线虫通常在0～40℃温度下均能生存,不过很少能在40℃存活较长时间,但不同种或不同品系的线虫对温度耐受力不同。新疆土壤温度高、湿度低和盐分大,筛选抗逆性较好的线虫种或品系成为新疆本土生物防治害虫的关键。【拟解决的关键问题】利用新疆本土昆虫病原线虫资源研究非生物胁迫耐受特性,测定其繁殖能力、耐热性和耐盐度,以期得到一株繁殖能力和抗逆性较强、杀虫活力高的昆虫病原线虫,并分析其共生细菌对相关病原微生物的拮抗作用,为拮抗病原微生物提供更多新型拮抗菌资源。

1 材料与方法

1.1 材 料

1.1.1 供试线虫

昆虫病原线虫小卷蛾斯氏线虫(Steinernemacarpocapsae):All、XJ-94,夜蛾斯氏线虫(Steinernemafeltiae):XJ-39、40-4,海滨斯氏线虫(Steinernemalitorale):XJ-62、B-13均由新疆农业科学院微生物应用研究所农用微生物研究室作物有益微生物团队分离和保存。

最可恼的一次，是一位名叫宋歌生的师兄，他领着出恭牌去小解，发现临空架在水潭之上的茅厕，坑位之前有一棵楠竹根部油光水滑，他问过其他几位男弟子，明白这是颜师父出恭的时候，会一边抱着竹子格物致知，思考悬垂露成竖的法门，一边五谷轮回方便如斯，宋师兄伙同曲风、刘歆二人，悄悄将那棵竹子的根部用小刀挖空。

参照Glazer等[20-21]方法测定3种线虫在35、38和40℃下的高温耐受性。取新收集的活力为100%的线虫悬浮液1 mL于2 mL离心管中,浓度为100 IJS/mL,用封口膜封住后置于不同温度的水浴锅中,处理1、2、3、4、5、6 h,每个处理3次重复。在设定的时间从试管中吸取100 μL混匀的线虫悬浮液,转移至干净的玻璃培养皿中,加入3 mL无菌水放置于25℃恒温培养箱中,24 h后记录不同种线虫的死亡情况。

大肠杆菌(E.coli),沙门氏菌(Salmonella),金黄色葡萄球菌(S.aureus)由新疆农业科学院微生物应用研究所农用微生物研究室作物有益微生物团队保存。

曾先生在车上要求警察将他们送到安全的地方。当地时间凌晨2点半左右，曾先生三人被带到“林地公墓”附近。曾先生向环环形容称，“当时周围一片漆黑，打开地图一看是片墓地。我认为这对于中国老人而言是一种侮辱，是警察在捉弄我们。”

研究表明,在不同时间下各剂量线虫对大蜡螟幼虫的致病力不同,随着线虫剂量的增加,大蜡螟幼虫的校正死亡率上升。侵染时间为24 h时,不同剂量线虫对大蜡螟的校正死亡率均低于10%;36 h时,校正死亡率显著升高(P<0.05),线虫剂量200 IJs/larva对大蜡螟的校正死亡率达到86.67%;48 h时,线虫剂量为160和200 IJs/larva的校正死亡率达到100%,较低线虫剂量20 IJs/larva下,大蜡螟的校正死亡率也达到了73.33%,小卷蛾斯氏线虫XJ-94的致病力较强。图3

1.1.3 供试昆虫

我国可溶岩分布达1/3以上国土面积，有22个省份有分布，其中以桂、黔、湘、赣、川、滇、鄂等省区最为发育。岩溶塌陷不仅造成工业与民用建筑毁坏，破坏交通和水利水电设施，还造成岩溶区严重的地质环境恶化。基于此，国内一些学者对岩溶塌陷形成条件和成因机理进行了深入研究，取得了丰硕成果 [1～6]。福建省岩溶塌陷主要集中发生于闽西南山间盆地覆盖性岩溶区(龙岩新罗区、永安大湖、连城北团、三明市区等)[7,8]。本文所述岩溶塌陷位于三明市大田县境内覆盖性岩溶区。在调查、勘查的基础上，对区内岩溶塌陷特征和成因进行了总结和分析。

大蜡螟5龄幼虫(Galleriamellonella)由新疆农业科学院微生物应用研究所农用微生物研究室作物有益微生物团队人工培养。

傍晚时沿着城墙根散步，我们似乎感受到了历史的挤压和古老文明所具有的源源活力。而从幽暗高大的城门洞穿过，则是一种更为奇特的体验——仿佛从这里便可径直走进秦时明月汉时关。

1.1.4 供试培养基

鉴别培养基(NBTA):氯化钠5 g,蛋白胨10 g,牛肉膏5 g,琼脂粉15 g,溴百里酚蓝0.025 g,氯化三苯基四氮唑0.04 g,蒸馏水1 000 mL,pH(7±0.2),NA固体和NB液体培养基购自北京奥博星生物技术有限责任公司。

1.2.2 线虫的耐热性测定

1.2.1 线虫的分离及扩繁能力测定

取新收集的活力为100%的线虫悬浮液1 mL于2 mL离心管中,浓度为100 IJS/mL,测定在不同盐浓度(5%NaCl、9%NaCl、13%NaCl、17%NaCl)下的耐盐性。放置在25℃室温下,处理1、2、3、4 h,每个处理3次重复。在设定的时间段观察死亡情况,计算死亡率。

1.2 方 法

1.1.2 病原菌

1.2.3 线虫的耐盐性测定

采用改良的White trap法[17],以100条/虫的线虫剂量侵染大蜡螟5龄幼虫[18],对侵染致死的大蜡螟幼虫进行称重,平均每条幼虫质量为0.4 g。在直径15 cm的培养皿中倒置一直径为9 cm的小培养皿,加入20 mL含适量0.1%甲醛溶液的去离子水,在小培养皿上铺两层灭菌滤纸,将5只侵染致死的大蜡螟幼虫置于其上,重复3组,室温25℃放置约14 d。待侵染期线虫从死亡的大蜡螟体内钻出进入水中后,将含有线虫的水溶液转移至烧杯中,反复换水,静置沉淀收集。待线虫收集完毕,采用稀释法记录线虫总数量,计算出每条大蜡螟幼虫产出侵染期线虫的数量(IJs/larva)和每克大蜡螟幼虫产出侵染期线虫的数量(IJs/g)[19]。

1.2.4 不同线虫剂量对大蜡螟幼虫致病力测定

以筛选出的抗逆性较好的线虫品系为实验对象,配制5个不同浓度的线虫悬液:100、300、500、800和1 000 IJS/mL;每个浓度为1个处理,每处理重复3次,将各浓度线虫悬液用移液枪取2 mL均匀加入到垫有双层滤纸的9 cm培养皿内,对照组为等量无菌水,每皿放大蜡螟幼虫10头(平均0.4 g/larva),置于人工气候箱(25℃,RH50%,无光照),每12 h观察1次并记录死亡情况。

1.2.5 昆虫病原线虫共生菌的分离

将线虫侵染致死的大蜡螟幼虫放置于超净台内,在75%的酒精中消毒10 s,用无菌滤纸吸去表面残留酒精,用无菌剪刀剪去一对腹足顶端,用接种环蘸取血淋巴液后划线于NBTA培养基平板上,28℃培养箱暗培养2～3 d,挑取蓝绿色单菌落再次划线于NBTA平板上进行纯化。

1.2.6 共生菌发酵液及上清液的制备

在NBTA培养基上挑取蓝色的I型菌接入100 mL含有NB培养液的三角瓶中,于180 r/min,28℃恒温摇床振荡培养24 h,得到种子液。将种子液以1%的接菌量转接于NB培养基中,于180 r/min,28℃恒温摇床振荡培养48 h,得到发酵液。将制备好的共生菌培养液在12、24、36、48、60、72 h各取样3 mL,经4℃,10 000 r/min离心10 min,得到共生菌上清液,置于4℃冰箱中保存。

1.2.7 共生菌拮抗病原菌实验

将共生菌接种到NB培养液体摇瓶中,共生细菌培养分时段取样,在12、24、36、48 、60、72 h各取样3组,每组1.5 mL,10 000 r/min离心5 min,取上清,冻存,备用。取100 μl病原菌悬浮液均匀涂布NA平板,每种病原菌涂布6个NA平板,总共54个NA平板。待涂布的病原菌悬液吸收后,在平板上用0.8 cm打孔器均匀打3个孔,加入200 μL共生菌上清液,放入28℃培养箱中,培养48 h,观察并测量抑菌圈直径。

学生对体育教学评教的有效性是教学评价中最为核心和关键的一项内容，在完善学生评教内容上，要同时强化体育教师和学生的思想意识，要明确进行教学评教的目的是为了对体育教学进行改进，尤其是学生要在评教中具有主人翁的权利意识，要意识到真实表达评价是行使权力的表现。完善评价内容还包括评教方法的丰富和多元化，由于高校体育教学具有特殊性，在评教上也要结合其特点，进行评价标准和项目的特殊设置，要结合体育教学发展的需求来收集相关的信息。

1.3 数据处理

应用origin 2021和SPSS 20.0进行数据处理统计和方差分析。利用SPSS 20.0软件中LSD和Duncan’s多重比较法进行差异显著性测定,P<0.05。

2 结果与分析

2.1 线虫数量测定

研究表明,被侵染的昆虫体内分离出来的线虫中小卷蛾斯氏线虫(All)和(XJ-94)数量明显多于其它种类的线虫。每条大蜡螟体内产出的线虫数量分别为5.24×104、4.96×104IJs/larva,平均每克大蜡螟幼虫产出线虫数量分别为1.31×104、1.24×104IJs/g。表1