高通量连接探针扩增技术联合STR分型在孕早期稽留流产中的应用*

顾丽泽，王金俏，王 鹏，张 姝，刘 颖，王 亿，方 媛

(徐州市妇幼保健院遗传医学中心，徐州 221009)

临床上约有10%～15%的妊娠发生流产，多为早期流产。胚胎发育异常为早期自然流产最常见的原因，其中50%～60%为染色体异常[1]。近年，随着分子生物学技术的发展，染色体微阵列芯片(chromosomal microarray analysis，CMA)技术因其具有高通量、高分辨率、无需绒毛培养等优势逐渐用于流产组织遗传学检测[2]。但因其价格昂贵、实验过程复杂、周期长等原因在临床应用中受到限制。高通量连接探针扩增(high throughput ligation dependent probe amplification，HLPA)技术是在传统多重连接探针扩增(multiplex ligation dependent probe amplification，MLPA)技术基础上改良后用于多重基因拷贝数检测的分子遗传学技术[3]，具有通量高、检测速度快、价格低等优势。本研究选取稽留流产患者的绒毛组织样本进行短串联重复序列(Short tandem repeat，STR)分型检测，排除母体细胞污染样本[4]，成功入组的样本进行CMA或HLPA检测，探讨两种检测技术在流产病因学研究中的临床应用价值。

1 资料与方法

1.1 研究对象 选择2019年12月至2022年3月在徐州市妇幼保健院就诊的稽留流产患者283例，年龄22～42岁，孕7～13+6周，彩超提示胚胎停止发育。经遗传咨询后自愿选择流产组织物CMA或HLPA检测。本研究经医院伦理委员会批准通过，患者充分知情并签署知情同意书。

1.2 实验方法

1.2.1 样本制备 收集患者外周血样本及稽留流产绒毛组织。选取10～20mg流产绒毛组织，生理盐水反复清洗，挑选适量绒毛充分研磨，彻底消化后采用DNA抽提试剂盒(TIANamp Genomic DNA Kit,DP304)提取DNA。抽取患者外周血2mL，提取DNA。

1.2.2 STR分型检测 先将绒毛组织及母体血液DNA样本进行多重荧光PCR扩增，扩增产物在Applied Biosystems 3500型遗传分析仪上进行电泳分析。STR分型检测共计17个检测位点，包括10个常用个体鉴别基因座、性别基因座及6个具有高杂合度的基因座。通过GeneMapper软件分析原始数据文件，根据产物峰分析是否存在母体污染、绒毛样本是否为多倍体或单亲二倍体。若母体血液样本中各位点的目标峰均能在流产样本检测图上找到，则判定为母体污染，母体细胞污染的样本不再进行后续检测。

1.2.3 HLPA检测 采用CNVplex®高通量DNA拷贝数检测技术(苏州天昊公司)，检测范围覆盖24条染色体的341个基因位点，实现对所有染色体非整倍体以及大于5M染色体末端缺失重复突变的检测。按操作说明书，实验过程包括连接反应、连接产物多重荧光PCR扩增、扩增产物荧光毛细管电泳分离以及数据读取。对读取的电泳图谱进行分析，获取各个基因位点连接探针扩增产物的峰高，分析确定样本目标基因片段的拷贝数。

1.2.4 CMA检测 采用美国Affymetrix公司的CytoScan 750芯片平台检测样本，通过基因组DNA消化、扩增、产物纯化、片段化、标记、杂交等实验过程，应用ChAS系统分析单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)和拷贝数变异，严格按标准操作流程进行实验。

1.3 统计学处理 采用SPSS 20.0软件。计数资料采用n和%表示，数据分析采用χ2检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 两种检测方法异常检出率 283例样本，STR分型排除母体污染3例，考虑原因可能是绒毛已退化混有母体组织，实际成功入组280例。检出染色体异常56.79%(159/280)，其中染色体数目异常94.34%(150/159)，染色体结构畸变5.03%(8/159)，单亲二倍体0.63%(1/159)。HLPA检出染色体异常56.43%(79/140)，CMA检出染色体异常57.14%(80/140)，两者差异无统计学意义(χ2=0.015，P=0.904)。

2.2 染色体数目异常 150例染色体数目异常中，HLPA+STR检出76例，CMA检出74例。染色体三体检出率最高，占66.00%(99/150)，其中16-三体占32.32%(32/99)；其次为染色体单体(特纳综合征)占19.33%(29/150)；三倍体10.00%，复合非整倍体3.33%，嵌合体1.33%，2例嵌合体均为CMA检出。见表1、2。

表1 HLPA+STR与CMA检出染色体数目异常类型[n(%)]

2.3 染色体结构畸变 本组样本中检出染色体结构畸变8例。染色体结构畸变的胚胎样本，提示其父母双方染色体可能存在染色体结构重排，需进一步遗传学检测。(1)HLPA+STR检测出3例染色体结构畸变，患者夫妻双方均行外周血染色体核型分析，其中1例为染色体平衡易位携带者，2例为新发突变。(2)CMA检测出5例，缺失或重复片段长度3例大于10Mb，2例小于2Mb，见表3。

表2 HLPA+STR与CMA检出染色体非整倍体结果[n(%)]

表3 HLPA+STR与CMA检出染色体结构畸变结果比较

2.4 HLPA联合STR技术 HLPA检测存在局限性，无法测出多倍体和单亲二倍体，因此需联合STR技术。STR判定三倍体标准：≥14个个体鉴别位点都是3种情况(1个峰、2个峰高比例接近2∶1的峰、3个峰高比例接近1∶1∶1的峰)之一，可判定为三倍体。病例1，HLPA检测结果为正常女性(图1A)，STR峰值图符合三倍体判定标准(图1B)，且性别鉴定位点只含有X峰，无Y峰，因此该病例判定为三倍体(69,XXX)(图1C)，同时该样本为绒毛水肿，病理诊断为完全性葡萄胎。病例2，HLPA检测结果显示X染色体相对拷贝数为1～1.5，Y染色体相对拷贝数为0.5～1.0，存在异常(图2A)，因此需结合STR结果分析，STR峰值图符合三倍体判定标准，性别鉴定位点同时含有X/Y峰，且X/Y峰高比接近2/1，则判定该病例为三倍体(69,XXY)(图2B、2C)。

图1 HLPA联合STR检测病例1

图2 HLPA联合STR检测病例2

3 讨 论

近年来自然流产在育龄妇女中的发生率呈增高趋势，发病原因较复杂，包括遗传因素、免疫因素、内分泌异常、感染、解剖学异常、环境及其他未知因素，其中胚胎发育异常为早期自然流产最常见的原因，流产组织物遗传学检测可为临床优生遗传咨询提供基础[5]。本研究纳入稽留流产组织样本283例，其中检测成功280例，检测成功率98.94%，染色体异常样本检出率为56.79%，与文献报道(56.40%)基本一致[6]。其中染色体数目异常占总异常的94.34%，染色体结构畸变占5.03%，染色体异常的样本中染色体三体的发生率最高，其中16-三体的发病率居于首位。因此，早期流产组织物染色体检测在分析流产原因中占据十分重要的地位，为自然流产诊治提供了新的思路。

流产绒毛染色体检查的传统技术是绒毛细胞培养及染色体核型G显带，其准确率高达99.5%，可同时检测出染色体数目和10Mbp以上片段的结构异常，但其主要弊端是需经细胞培养，检测周期较长，细胞培养有一定难度，存在较高的失败风险，标本制备易受样本质量、取材时间、母源性细胞污染等影响，且对染色体分析技术要求较高[7-8]。探寻便捷准确的染色体数目异常检测方法尤为重要。HLPA技术是在传统MLPA技术基础上改良后用于多重基因拷贝数检测的分子遗传学技术，其技术优势在于探针分布更广，通量更高，检测结果更趋精准。与传统染色体核型分析相比HLPA技术具备以下优势：(1)操作成功率较高，该技术不需通过细胞培养及收获，直接提取胎儿绒毛组织DNA进行检测；(2)检测时间较短，一般成功提取DNA后24～48h可得到检测结果；(3)显著降低人员成本，实验操作较简单，自动化程度较高。本研究所采用的HLPA技术主要对所有染色体非整倍体以及大于5Mb以上的染色体末端的缺失重复突变进行检测，而这类大片段的末端缺失和末端重复类的染色体结构异常，提示父母双方可能为一方或双方为染色体平衡易位携带者，为指导患者再次生育具有重要意义。

随着分子生物学的快速发展，近年来CMA技术在产前遗传学检测中应用较广泛，可检测染色体非整倍体拷贝数变异(copy number variant,CNV)，尤其对于检测染色体微缺失/重复等拷贝数变异具有突出优势。目前对于产前超声检查发现的胎儿结构异常，CMA是较有效的遗传学诊断方法[9-10]，但其价格高昂，在流产组织物遗传学病因检测的临床应用上受到很大限制。本研究结果发现，CMA和HLPA检测方法对于胚胎染色体非整倍体的检出均具有准确度高、重复性好、通量高的优势，但CMA在小片段缺失重复检出中的优势更突出[11]。HLPA技术因检测价格低廉、检测周期较短更易被患者接受。HLPA技术仍存在一定局限性，HLPA是根据分析染色体特异性探针结合区域核酸拷贝数的变化，从而进一步评估染色体有无剂量变化，因在正常女性、单亲二倍体、三倍体或多倍体女性样本中X染色体与常染色体的相对拷贝数是相同的，故HLPA无法区分。所以，需联合其他技术弥补在多倍体及单亲二倍体方面的检出，STR技术在该方面可以起到补充作用。

通过对多态性位点的STR进行扩增，并应用毛细管电泳对染色体数目异常进行分析，不仅可以准确判读多倍体及单亲二倍体，同时能够对流产组织样本的质量进行初步分析，排除母体污染，提高准确度。通过本研究可以发现，HLPA联合STR技术在胚胎染色体非整倍体的检测中与CMA技术相比同样具有准确度高、灵敏性强等优势。但是HLPA技术受到探针覆盖不足的限制，可能无法检出一些小片段的染色体拷贝数异常，如一些非末端的拷贝数变异，存在漏检风险。但这些小片段的微缺失/微重复与早孕期胚胎停止发育的相关性尚不明确，有待进一步研究。

综上所述，HLPA联合STR技术具有便捷、高效、灵敏、准确、价廉等优势，能较好地用于检测早孕期稽留流产组织染色体异常，易于在临床推广应用，为优生遗传咨询提供有力证据，可有效指导孕妇再次妊娠。