不同体液标本活检在肺癌微小残留疾病监测中的应用最新进展

闫星，刘山梅，刘长宏*

经过几十年的相关探索，肺癌患者的管理方法发生了深刻变革。可以明确的是，疾病监测是治疗成功的基础，目前在肺癌的临床诊疗过程中因复发导致术后患者死亡的百分比仍然很高（2年内ⅠB期患者复发率为45%、ⅢA期患者复发率高达76%）［1］。因此作为肿瘤复发的“罪魁祸首”——微小残留疾病（MRD）越来越受到临床重视。MRD是指经过治疗后，传统影像学或实验室检查不能发现，通过液体活检发现的癌来源分子异常，代表恶性肿瘤的持续存在和临床进展可能［2］。在TRACERx研究中［3］，经液体活检分析证实99%以上没有复发的非小细胞肺癌患者MRD阴性，并且发现在通过标准成像检测到疾病之前复发的患者中可以检测到MRD。目前检测MRD的新兴手段之一便是液体活检，通过分析血液及其他体液中的循环肿瘤细胞（circulating tumor cell，CTC）、 循 环肿 瘤 DNA（circulating tumor DNA，ctDNA）、外泌体等来源于实体瘤的生物标志物监测肿瘤进展，可为后续治疗提供临床决策。液体活检不同于组织活检的是可以多次、连续进行识别肿瘤驱动突变、跟踪肿瘤演变和监测疾病复发的无创操作，且操作方式更加便捷，能够动态反馈疾病的进展，相关报道称液体活检可使患者避免约5%与CT引导肺组织活检相关的主要并发症［4］。同时液体活检可以完全反映肿瘤的异质性，为患者术后进行个体化靶向治疗、改善预后提供更多机会。本文综述了几种热点液体（外周血、尿液、唾液、痰液、胸腔积液）标本在肺癌MRD检测中的进展，并探讨多元化液体活检标本分析指导肺癌MRD精准治疗的应用价值，期待其成为未来指导临床决策并改善患者预后的一条崭新道路。

1 肺癌MRD液体活检的优势及挑战

传统检查（包括组织活检、影像学、生化指标等常规检查）一直在肺癌的发生、发展监测及治疗过程中起着重要作用，在液体活检应用于临床之前其是包括原发性肺癌在内的恶性肿瘤病理诊断、分期和治疗决策的“金标准”。然而，传统检查受限于操作与时效性而难以真正推动肺癌MRD监测的发展。液体活检的优势在于，首先相对于组织活检其是一种非侵入性操作，患者的体液可以很容易地重复取样，这使得在治疗过程中可以通过连续取样来监测肿瘤特征（“实时活检”），同时打破了其肿瘤异质性的取样局限。ROTHWELL等［5］的一项研究发现，39例晚期实体瘤患者的循环游离DNA（circulating free DNA，cfDNA）和患者相应肿瘤组织DNA的高通量测序（NGS）显示，在肿瘤组织中未检测到的突变是来自血浆样本的30%；其次，液体活检相对于常规检测具有时间优越性及较高的特异度。TRACERx研究发现［3］，术后ctDNA预测肺癌患者36个月复发的灵敏度为48%，特异度为100%；且ctDNA检测和影像学复发之间的中位时间为167 d，而癌胚抗原（CEA）升高和影像学复发之间的中位时间为61 d，相比较液体活检缩短了临床诊断复发间隔时间，争取了复发前治疗优势。有趣的是一份报告描述了1例ⅡB期非小细胞肺癌患者接受了放射治疗且影像学检查显示有残留肿块，尽管该患者在治疗后没有检测到ctDNA，但根据ctDNA连续监测，该患者在治疗22个月后被视为无病状态［6］，事后来看，该肿块代表辐射诱导的炎症变化，这也引起了业界对影像学筛查导致假阳性率过高以及辐射风险的关注。然而，液体活检要想进一步在临床应用中大有作为仍存在一些挑战，例如克隆性造血（cloning of hematopoietic，CH），在没有已知驱动突变的情况下，随着非小细胞肺癌患者年龄增长，通过cfDNA检测到造血干细胞在造血的随机过程中可能获得突变，而大多数JAK2突变和部分TP53突变可能是由于CH，这就使得样本中CH相关突变的检测可能被错误地解释为肿瘤切除后MRD的指示。研究者目前正在采用各种方法从真正的肿瘤DNA衍生突变中筛选出CH相关突变。最直接的方法是对有核白细胞进行深度测序（CAPP-Seq）以识别克隆性造血突变，并将其从样本中排除［7］。虽然该方法在技术上可行且操作简单，但其却将成本翻了一番。其他如基因片段太小、t1/2短以及随着治疗效果显现，肿瘤DNA比例会大幅度下降等。鉴于检测成本较高及缺乏分析方法共识，目前液体活检仍不能完全替代传统检查，但作为后者的辅助检测手段，未来的研究必定需要将两者更好地结合起来，监测与评估MRD状态，进而完善肺癌患者术后个体化治疗。不同液体活检的比较见表1。

表1 不同液体活检比较Table 1 Comparison of five types of body fluid biopsies

2 体液标本活检

2.1 外周血 从早期至晚期肺癌，随着实体瘤的进展、转移、复发等，大量的肿瘤细胞及其衍生物会进入外周血液循环中，在影像学检查和血清学检查发现之前其是准确、可靠地识别MRD并指导后续治疗决策的标本。采集血液检查比活组织检查具有更小的侵入性，这使其易于获取，并允许对癌症进行近实时监测。外周血样本中主要活检对象包括CTC、ctDNA以及外泌体等，特征比较见表2。目前国内外大量临床试验以及分析处理的方法已基本达成共识，使得上述对象在以血液为载体的基础上进行活检成为目前最常用的方法。而某些特定体液中的肿瘤细胞及其衍生物因无法如同全身循环的血液那样反映癌症转移的具体情况，在临床实际应用中尚处于探索阶段。此外，相比于血液，其他体液有着更加复杂的微生物环境，微生物自身及其代谢物会对检测结果造成难以预测的影响。目前血液活检技术可根据其基因组覆盖范围进行分类，从靶向等位基因特异性聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）到NGS技术，如杂交捕获NGS、全外显子组测序和全基因组测序。所有检测方法共同面临的问题包括血浆ctDNA含量低、正常（非肿瘤）细胞产生的cfDNA背景丰富以及发现的基因变异来源不确定，但随着技术的进步，使用个性化的基因测序跟踪更多的突变可以提高这些平台在检测低容量MRD时的灵敏度。

表2 外周血中三种常见活检对象比较Table 2 Comparison of three common liquid biopsy biomarkers in peripheral blood

2.1.1 CTC 是指从原发肿瘤或转移灶脱落、发生上皮-间质转化进入患者外周血血液循环的恶性肿瘤细胞［8］。肿瘤复发需要许多病理生理级联反应，在这些癌症扩展、生长和转移的基本过程中，CTC可能参与了转移这一重要阶段。CTC是血管中一种极其罕见的细胞，外周血液中的数量非常少（1 ml全血中仅含有1～10个CTC）［9］，从文献回顾来看，绝大部分肺癌患者中均可发现CTC［10］。对于早期肺癌，可从外周血中检测到甲状腺转录因子-1（TTF-1）阳性CTC，并与不良预后和更短的进展期相关［11］。对于经证实有远处转移或复发的肺癌患者，CTC数量越多，预后越差，并且LINDSAY等［12］的报告指出CTC将是晚期非小细胞肺癌无进展生存率（PFS）和总生存率（OS）的独立预后指标。因此，CTC可作为肺癌患者的一种动态监测工具来观察治疗前后肿瘤动力学的变化。在上述文献回顾的研究中，26例患者早期肺癌术前和术后第0天、第1天和第3天进行CTC检测，发现复发肺癌患者CTC计数的下降斜率较低，而无复发患者的CTC下降斜率较高。对于有肺转移的肺外恶性肿瘤，肿瘤切除后CTC下降，术后第3天CTC反弹至更高水平，即使在影像学上可见病变已完全切除。表示CTC可以作为MRD检测的一种工具，并且可以预测治愈性术后几个月的复发情况。

2.1.2 ctDNA 定义为肿瘤细胞脱落到体循环中的短DNA序列，来源于死亡CTC的分解产物或肿瘤细胞的活性分泌，是cfDNA片段中的一小部分，尽管比例不到1%但测序技术的进步已经可以满足检测与肿瘤生物学相关的突变和染色体改变［13］，且ctDNA的t1/2约为2 h，比其他肿瘤标记物的t1/2更短［14］。在肺癌发展过程中，肺肿瘤组织可能获得一系列体细胞突变。某些突变如EGFR T790M会产生耐药性，并影响患者的总体生存率。2016年美国食品和药物管理局（FDA）批准cobas EGFR突变试验V2［15］作为在肺癌中使用ctDNA检测MRD的第1次液体活检试验。因ctDNA检测隐匿性癌症和动态追踪肿瘤特异性突变的潜在能力，连续血浆样本中跟踪检测肿瘤基因突变已经用于晚期非小细胞肺癌患者的临床决策［16］。另一方面术后ctDNA与患者后期复发率呈正相关，在一项包含230例肺癌患者术后的研究中［17］，研究者通过血浆样本中相对于健康对照组中最高突变等位基因分数（MAF）量化的ctDNA确定了ctDNA阳性和阴性患者术后无复发生存率（RFS）的显著差异，且认为术后ctDNA状态对RFS的影响大于任何单个临床病理风险因素或任何因素组合，术后灵敏度、特异度皆高于其他检测手段。目前克隆性造血和组织活检之间的基因组差异性仍是ctDNA检测存在的明显局限性，但随着NGS及数字PCR（dPCR）等技术的进步，ctDNA检测的灵敏度也在逐渐提高。

2.1.3 外泌体 JOHNSTONE等［18］在研究网织红细胞的成熟过程时首次发现并命名外泌体。外泌体是一种球形囊泡，直径为40～100 nm，密度为1.13～1.19 g/ml，其内主要核酸包含microRNA（miRNA）、tRNA和长非编码RNA（lncRNA），以及大量片段化的信使RNA（mRNA）。外泌体的分离方法主要有基于物理（如大小、密度和分子量）特性、沉淀、微流体、免疫亲和捕获的技术，目前超速离心和商用试剂盒提取法是分离外泌体最广泛使用的常规方法［19］。尽管所有类型的细胞会释放出外泌体，但肿瘤细胞中的外泌体非常丰富。研究表明肿瘤细胞源性外泌体在肿瘤生物学过程中起着重要作用，其负责促进受体细胞的血管生成、侵袭和增殖，通过将其内容物转移到肺癌微环境中的靶细胞参与肺癌的形成和进展［20］。癌细胞外泌体包含多种与癌症相关的蛋白质，例如表皮生长因子受体（EGFR）是肺癌外泌体中的主要膜结合蛋白，从肺癌细胞中提取的外泌体中约有80%呈EGFR阳性［21］，而肿瘤源性外泌体衍生的miRNA也可能是影响非小细胞肺癌患者生存率的独立预测因子［22］。RABINOWITS等［23］评估了血浆样本循环肿瘤外泌体水平对27例肺腺癌患者和9例健康对照的诊断和预后潜力，发现腺癌患者的外泌体水平（平均2.85 mg/ml）、外泌体miRNA浓度（158.6 ng/ml）均高于健康对照（平均0.77 mg/ml、68.1 ng/ml）。

2.2 唾液 唾液由唾液腺中的腺泡细胞产生，腺泡细胞具有很高的渗透性，且周围有丰富的毛细血管，使血液中的分子能够与相邻唾液细胞中的分子自由交换［24］，目前血液中大约40%的肿瘤标志物也可以在唾液中找到［25］。加之唾液的收集速度快、简单、便宜、无创，表明唾液可以被视为一种理想的液体活检标本。GU等［26］首次将血浆CTC和唾液mRNA生物标志物联合应用于非小细胞肺癌的无创检测，在区分早期肺癌患者和健康对照组的研究中其灵敏度和特异度分别高达92.1%和92.9%。非小细胞肺癌患者和健康人群之间唾液cfDNA的定量或浓度无显著差异［27］。然而，血浆cfDNA和唾液cfDNA之间EGFR突变的一致性为83.78%，scfDNA能够作为基因突变的补充［28］。EGFR是一种在NSCLC中频繁表达的膜受体，其影响NSCLC细胞的增殖、血管生成和MRD复发及化疗耐药性，并促进NSCLC细胞的转移［29］。频繁对术后肺癌患者进行血液活检监测EGFR突变是不切实际的，而唾液活检恰可以为肺癌MRD提供另一个有希望的诊断补充。加州大学洛杉矶分校（UCLA）牙科学院开发的电场诱导释放和测量（EFIRM）技术可以检测肺癌患者体液中表皮生长因子受体（EGFR）突变。LI等［30］在13例非小细胞肺癌患者唾液样本中利用上述技术检测到循环肿瘤DNA（sctDNA）EGFR突变，灵敏度为100%。另一些肿瘤生物化学指标与肺癌患者的生存率显著相关［31］，例如咪唑化合物（ICs）浓度和唾液乳酸脱氢酶（LDH）活性，这两个参数的组合被用作评估肺癌预后及存活率更为有效。对于预后良好（ICs<0.311 mmol/L和LDH>1 133 U/L）的患者，1年、3年和5年生存率比预后不良的患者均高2倍。而C反应蛋白（CRP）水平可能也会随着肿瘤大小和区域转移而升高。

2.3 尿液 经治疗后MRD血浆中ctDNA和CTC的含量较低，在连续监测病灶进展过程中需要提取相对大容量的血液，尽管是微创但患者仍然会感觉到不适。研究表明外周血中的cfDNA能够通过肾屏障并经过尿液排泄［32］，CHEN等［33］对非小细胞肺癌患者匹配的3 ml外周血和8 ml尿液样本共计150份进行分析，从中获得的cfDNA数量没有统计学差异。且尿液易于储存和运输，更易于提取大容量样本，从尿液样本中获取关键疾病信息的可能性为补充传统的肿瘤取样方法提供了更多选择。MRD阳性意味着癌症治疗后血液中可检测到来自肿瘤的DNA，那么尿液中检测到的DNA水平也可以类似地指示肿瘤负担相关性。在先前的报道中利用尿液DNA追踪肿瘤特异性突变并针对耐药性给予个体化治疗，临床应用被证明适用于晚期非小细胞肺癌患者［34］。LI等［35］发现治疗后可检测到尿ctDNA的存在与肺癌患者的疾病复发明显相关，尿ctDNA检测不到的患者有较好的无病生存率，可检测到ctDNA的患者3、6和9个月复发概率对应为15.6%、6.6%和5.1%。表明尿ctDNA对疾病复发风险有一定的前瞻性，尤其是对突变DNA检测不到的患者进行甄别具有良好的临床实用性。LEE等［36］指出在治疗后阶段EGFR突变持续阳性的NSCLC患者可能存在残余病灶，需要进一步治疗或加强疾病复发监测。特别是T790M突变与疾病进展时间缩短和总体生存率降低密切相关。CHEN等［33］对150例非小细胞肺癌患者分组后发现，尿液DNAT790M阳性组患者的总体生存结果明显最差，中位生存率为30个月，T790M阴性组的中位生存率为34个月，进一步验证了尿液DNA在治疗后患者风险分层和疾病监测中的临床实用性。

2.4 痰液 美国国家癌症研究所（NCI）［37］进行了一项肺癌的低剂量螺旋计算机断层扫描和痰细胞学双重筛查研究，双重筛查诊断的90例患者中有18例（20%）痰标本呈癌症阳性，但影像学检查呈阴性，表明痰液在诊断临床上处于缓解期或隐匿期的癌症相比较影像学具有时间优越性，但因为大多数肺癌患者痰液样本量较少，致使其包含的肿瘤细胞数量有限，加之痰液中的黏性黏液成分使得肿瘤源性的DNA提取更加困难。这也是液体活检相对较少使用痰液的原因之一。WANG等［38］制备了一种无甲醇黏液溶解溶液（MS2）改进从痰中分离肿瘤源性cfDNA，实验证明经治疗后患者的痰标本中利用MS2提取的cfDNA检测EGFR突变的灵敏度显著高于经MS1（传统的含甲醇的黏液溶解溶液）分离的同一队列痰标本，并在一项包括102例肺腺癌患者的研究中，通过实时荧光定量PCR（qRT-PCR）技术对痰cfDNA检测后发现，30例患者（29.4%）的EGFR突变状态呈阳性，总体灵敏度和特异度分别为46.2%和100.0%。MAO等［39］在肺癌患者临床诊断之前发现10例原发肿瘤中有8例患者的痰液样本中检测到K-ras突变和p53突变，这对提高肿瘤基因分型和肿瘤靶向精准治疗、发展围术期个体化治疗具有重要意义。研究证明miRNAs、mir-21和mir-155的过度表达是肿瘤切除后患者复发、预后及总体生存率的负面因素［40］。而痰液含有来自肺部和下呼吸道的支气管上皮细胞，痰液环境下miRNA对RNase活性具有抗性，能显著地以稳定形式存在，并且在储存长达7 d的痰液样本中也可检测到［41］。LIAO等［42］发现痰样本中miRNA组可以检测NSCLC，具有显著的灵敏度和特异度。来自较小气道的腺癌很难通过支气管镜或痰细胞学检查发现，痰中miRNA的表达将为肺癌的MRD监测提供一种高准确率的特异性标志物。并在无创的基础上对患者起到早诊断、早治疗的作用。

2.5 胸腔积液 恶性胸腔积液（MPE）是中晚期肺癌的一种常见并发症，是淋巴腺被肿瘤阻塞，组织液渗出积聚于胸膜腔内，与患者肿瘤复发、转移显著相关。与组织活检等其他侵入性技术相比，MPE非常容易收集。此外，与手术切除标本相比，肺癌相关MPE患者的突变率要高得多［43］。胸腔积液活检标本的生物标志物可能来自多个肿瘤克隆，因此其可以同时反映肿瘤以及播散性病变的异质性。同时足够来源的MPE为获得评估肿瘤基因组学提供了一个丰富的机会［44］。MPE的分子分析代表了一种检测肿瘤驱动基因突变的微创方法，尤其是当肿瘤组织不可用时，其可用于临床决策。MPE可能是提供EGFR等基因突变状态有用信息的替代来源。如果EGFR基因突变检测可以通过更多可获得的胸腔积液样本实现，将有利于探索MRD在驱动基因阳性和驱动基因阴性两种类型患者中的作用，并进一步探讨耐药机制，以及评估能否在影像学之前识别耐药的优越样本。晚期非小细胞肺癌患者的靶向药物治疗也将成为可能，这将具有重要的临床和实用价值。

2.6 胸腔积液上清液（MPEs） 晚期非小细胞肺癌患者胸腔积液上清液中的cfDNA的肿瘤基因突变丰度显著高于积液肿瘤细胞和血浆游离DNA样本，已成为在检测治疗靶点和肿瘤突变负荷（TMB）中优异的替代品［45］。在晚期肺癌MRD中，检测驱动基因EGFR的突变被用作靶向治疗的指导，TMB可用于评估免疫治疗的疗效。WANG等［46］对肿瘤组织、血浆和MPEs的EGFR突变状态进行比较，并将结果与EGFR-TKI疗法进行关联，结果证明在基于ctDNA的EGFR突变检测方法下肿瘤组织和MPEs之间EGFR突变灵敏度和特异度的高度一致，而血浆中的EGFR突变率最低。MPEs中的EGFR突变可以预测第一代EGFR-TKI治疗的疗效。经TKI治疗的EGFR突变患者的中位总生存期长于野生型EGFR患者，接受一线或二线EGFR-TKI治疗的MPEs中EGFR突变患者的ORR和DCR分别为56%和94%，与基于组织的检测结果一致。因此当两种样本均可用时，从MPEs中提取的游离DNA可能是比血浆更好的作为预测肿瘤对TKIs反应的生物标志物。同时YANG等［47］观察发现MPEs中EGFR突变患者的中位PFS显著长于野生型EGFR患者（7.33个月与2.07个月）。而SONG等［48］研究了使用肺腺癌患者MPEs外泌体DNA进行基因检测的可行性，发现在MPEs外泌体DNA中发现的78%的突变与MPEs ctDNA中发现的突变相匹配，支持其用于基因检测的可靠性。多渠道确定肿瘤基因原始突变状态和监测突变的变化对于肺癌的治疗至关重要。

3 总结与展望

将液体样本衍生的生物标志物应用于监测MRD、预测肿瘤反应和探索治疗耐药性等临床工作无疑是迫切需要的。液体活检作为一种分析变异的替代方法，不仅提供了一种非侵入性的方法来提前检测肺癌的改变，而且还补充了组织活检检测的结果，使更多的癌症患者能够接受精准治疗。在这个个体化精准医疗时代，MRD本身仍有很多问题有待进一步解决，未来的研究有必要确定如何最好地将肿瘤组织活检、临床检查和医学影像与液体活检的基因组学和MRD信息结合起来，从而使多元化液体活检标本分析应用于临床肿瘤工作成为指导临床决策并改善患者预后的一条崭新道路。

作者贡献：闫星提出研究选题方向，负责相关内容的文献收集和整理，并撰写论文初稿；刘山梅参与文献的收集和整理，负责论文的修订，与闫星在文章中所做同等贡献；刘长宏负责文章的质量控制及审校，对文章整体负责；所有作者确认了论文的最终稿。

本文无利益冲突。