姜黄素调控miR-551b-3p对食管癌EC9706细胞增殖、迁移、侵袭及凋亡的影响

耿锰行 孙玉信

(1河南中医药大学，河南 郑州 450046；2河南中医药大学第三附属医院)

食管癌是临床常见的恶性肿瘤之一，化疗是临床上治疗食管癌的主要方法之一，但治疗效果不佳且患者预后较差，中草药具有抗炎、抗癌等作用，已有研究表明甘草甜素等中药提取物可抑制食管癌的发展进程〔1～4〕。姜黄素是姜黄属植物根茎中的多酚化合物，其具有抗炎、抗氧化、抗肿瘤等作用，并可抑制多种肿瘤细胞的生长，研究表明姜黄素通过调节Notch信号诱导食管癌细胞凋亡〔5〕。miR-551b-3p在食管鳞癌细胞中表达水平降低，并可能参与食管鳞癌发生及发展过程〔6〕。但miR-551b-3p是否可作为姜黄素治疗食管癌的潜在靶点尚未可知。本研究探究姜黄素调控食管癌细胞增殖、迁移侵袭和凋亡的机制与miR-551b-3p之间的关系。

1 材料与方法

1.1材料与试剂 姜黄素(上海一研生物)；正常食管上皮细胞HEEC与食管癌细胞EC9706(美国ATCC)；Lipofectamine2000转染试剂(上海阳光生物)；miR-NC、miR-551b-3p mimics、anti-miR-NC、anti-miR-551b-3p(广州锐博生物)；Trizol试剂(美国Invitrogen)；反转录及qRT-PCR试剂盒均(日本TaKaRa)；CCK-8试剂(上海李记生物)；Transwell小室(北京优尼康生物)；Matrigel基质胶、凋亡检测试剂(北京索莱宝)；兔抗人G1/S特异性周期蛋白(Cyclin)D1、基质金属蛋白酶(MMP)-2、MMP-9、B细胞淋巴瘤(Bcl)-2、p21、Bcl-2相关X蛋白(Bax)抗体(美国CST)公司；二抗(北京中杉金桥生物)。

1.2实验分组 EC9706细胞分别加入含有不同浓度(5、10、20 μmol/L)姜黄素的培养液中培养24 h〔7〕，设置低、中、高剂量姜黄素组。空白的EC9706细胞设为对照组。转染miR-NC、miR-551b-3p mimics的EC9706细胞，设为miR-NC组、miR-551b-3p组。anti-miR-NC、anti-miR-551b-3p转染EC9706细胞后加入含有20 μmol/L姜黄素的培养液中培养24 h，分别记为高剂量姜黄素+anti-miR-NC组、高剂量姜黄素+anti-miR-551b-3p组。

1.3qRT-PCR检测miR-551b-3p表达 使用RNA抽提试剂盒提取待测细胞的总RNA，反转录合成cDNA，-20℃保存备用。按照qPCR试剂盒的操作说明书要求操作，检测cDNA中miR-551b-3p的相对表达量。

1.4CCK-8法检测细胞增殖 收集各组细胞，调整至适当密度2×105个/ml，按照100 μl/孔的剂量接种96孔板。在细胞培养箱中培养4 h后，取出每孔加入10 μl CCK-8溶液，微微震荡混匀，继续培养2 h，在490 nm波长下检测各组细胞的OD值。

1.5Transwell实验检测细胞迁移及侵袭 侵袭：Matrigel基质胶在稀释时，使用无血清培养基。将100 μl稀释液铺于上室，各组细胞经胰蛋白酶消化后采用DMEM培养基重悬(2×105/ml)，按照每孔200 μl的密度加入上室，取含胎牛血清DMEM培养基600 μl加入下室，继续培养24 h。上室底部朝上，用4%甲醛溶液固定20 min，再使用0.5%的结晶紫溶液染色15 min。迁移：上室不需加入Matrigel基质胶稀释液，其余同上。

1.6流式细胞术检测细胞凋亡 按照凋亡检测试剂盒说明书要求操作。具体步骤：用冷磷酸盐缓冲液(PBS)溶液洗涤细胞5次，结合缓冲液制备成悬浮液。用5 μl的膜联蛋白(Annexin)V、碘化丙啶(PI)染色，避光孵育20 min，流式细胞术检测分析并读取细胞的凋亡情况。

1.7Western印迹检测CyclinD1、MMP-2、MMP-9、Bcl-2、p21、Bax蛋白 细胞使用RIPA、超声裂解后，12 000 r/min，离心5 min，收集总蛋白。二喹啉甲酸(BCA)液对蛋白定量。将5倍的上样缓冲液与蛋白样品混合，并在沸水中煮沸10 min，进行变性。取变性后的上清上样行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，分离蛋白。转膜仪将蛋白湿转至聚偏氟乙烯(PVDF)膜，转膜后使用封闭液37℃封闭2 h。一抗稀释液4℃孵育过夜，二抗稀释液室温条件下孵育1 h。ECL显影，曝光。ImageJ软件分析蛋白条带的灰度值。

1.8统计学处理 采用SPSS26.0软件进行t检验、方差分析，两两比较采用LSD-t检验。

2 结 果

2.1miR-551b-3p在食管癌EC9706细胞中的表达 与HEEC细胞(1.01±0.04)比较，EC9706细胞中miR-551b-3p的表达水平显著降低(0.43±0.03，t=12.523，P=0.000)。

2.2姜黄素对食管癌EC9706细胞增殖、迁移、侵袭和凋亡的影响 与对照组比较，低剂量姜黄素组、中剂量姜黄素组、高剂量姜黄素组细胞活力明显降低，迁移侵袭数显著下降，凋亡率显著升高，CyclinD1、MMP-2、MMP-9、Bcl-2蛋白相对表达量显著降低，p21、Bax蛋白相对表达量显著升高(均P<0.05)，见图1、表1、表2、图2。

表1 姜黄素对食管癌EC9706细胞增殖、迁移侵袭和凋亡的影响

表2 姜黄素对食管癌EC9706细胞增殖、迁移侵袭、凋亡相关蛋白及miR-5516-3p的影响

A：EC9706细胞的迁移侵袭(结晶紫染色，×100)；B：细胞凋亡流式图图2 姜黄素对食管癌EC9706细胞迁移侵袭和凋亡的影响

2.3姜黄素对食管癌EC9706细胞中miR-551b-3p的影响 与对照组比较，低剂量姜黄素组、中剂量姜黄素组、高剂量姜黄素组miR-551b-3p的表达水平升高(P<0.05)，见表2。

2.4过表达miR-551b-3p表达对食管癌EC9706细胞增殖、迁移侵袭和凋亡的影响 与miR-NC组比较，miR-551b-3p组细胞活力明显受到抑制，迁移侵袭数均显著下降，凋亡率明显升高，CyclinD1、MMP-2、MMP-9、Bcl-2蛋白相对表达量明显降低，p21、Bax蛋白相对表达量显著升高(均P<0.05)，见图3、表3、图4。

A：EC9706细胞的迁移侵袭(结晶紫染色，×100)；B：细胞凋亡流式图图3 过表达miR-551b-3p表达对食管癌EC9706细胞迁移侵袭和凋亡的影响

表3 过表达miR-551b-3p表达对食管癌EC9706细胞增殖、迁移侵袭和凋亡及相关蛋白的影响

图4 增殖、迁移侵袭和凋亡相关蛋白的表达

2.5下调miR-551b-3p能逆转姜黄素对食管癌EC9706细胞增殖、迁移侵袭和凋亡的影响 与高剂量姜黄素+anti-miR-NC组比较，高剂量姜黄素+anti-miR-551b-3p组细胞活力显著上升，迁移侵袭数均明显上调，凋亡率显著降低，CyclinD1、MMP-2、MMP-9、Bcl-2蛋白相对表达量显著升高(P<0.05)，p21、Bax蛋白相对表达量显著降低(P<0.05)，见图5、图6、表4、表5。

图5 增殖、迁移侵袭和凋亡相关蛋白的表达

A：EC9706细胞的迁移侵袭(结晶紫染色，×100)；B：细胞凋亡流式图图6 下调miR-551b-3p能逆转姜黄素对食管癌EC9706细胞迁移侵袭和凋亡的影响

表4 下调miR-551b-3p能逆转姜黄素对食管癌EC9706细胞增殖、迁移侵袭和凋亡的影响

表5 下调miR-551b-3p能逆转姜黄素对食管癌EC9706细胞增殖、迁移侵袭和凋亡相关蛋白的影响

3 讨 论

目前食管癌的发病机制尚未完全阐明，临床主要采用手术切除等方式进行治疗，但食管癌具有高度侵袭性与转移性导致患者治疗效果降低，化疗等治疗方式又具有一定毒副作用，中医药在延缓病情与控制复发等方面具有重要作用，既往研究显示，橙皮素、紫花牡荆素等可促进食管癌细胞凋亡，还可抑制细胞转移〔8～10〕。中医药抗肿瘤作用主要通过多途径、多靶点而发挥作用，但姜黄素抗食管癌的分子机制尚未阐明。

姜黄素可抑制胃癌细胞增殖、迁移及侵袭，其作用机制可能与抑制Hsp90-JAK/STAT3信号通路有关〔11〕。姜黄素可能通过抑制Wnt/β-catenin信号通路从而抑制鼻咽癌细胞增殖及促进细胞凋亡〔12〕。姜黄素对乳腺癌细胞具有增殖、迁移侵袭抑制及凋亡促进作用〔13〕。本研究结果说明，姜黄素对食管癌细胞的增殖呈现抑制作用。细胞增殖相关蛋白CyclinD1、p21在食管癌中能够通过调控癌细胞的细胞周期进而调节癌细胞的增殖〔14〕。本研究结果进一步证实，姜黄素可通过抑制食管癌细胞增殖而发挥抗癌作用。MMP-2、MMP-9作为基质破坏的标志物，其表达水平的上调预示着细胞外基质的破坏，从而增强癌细胞的转移能力〔15〕。本研究结果提示，姜黄素可抑制食管癌细胞迁移及侵袭。Bcl-2是抗凋亡蛋白，而Bax是促凋亡蛋白〔16〕。本研究结果提示，姜黄素可明显促进食管癌细胞凋亡。

研究表明miR-551b-3p通过靶向CyclinD1而抑制人胆管癌的肿瘤生长，进一步研究发现LncRNA MIAT可通过调控miR-551b-3p/CyclinD1分子轴而促进胆管癌细胞的增殖〔17，18〕。本研究结果与上述实验结果相一致。抑制miR-551b-3p表达可明显拮抗姜黄素对食管癌细胞增殖、迁移侵袭及凋亡的治疗作用，说明miR-551b-3p在姜黄素的抗食管癌恶化中发挥了关键作用。

综上，姜黄素抑制食管癌细胞增殖、迁移侵袭，促进凋亡。食管癌细胞中miR-551b-3p的表达水平降低，而姜黄素可促进食管癌细胞中miR-551b-3p的表达，抑制miR-551b-3p的表达可拮抗姜黄素对食管癌细胞生物学行为的作用，表明姜黄素抗食管癌的作用与上调miR-551b-3p的表达有关，可为进一步揭示姜黄素治疗食管癌的分子机制奠定实验基础。