桃金娘叶乙醇提取物对小鼠蓖麻油性腹泻及兔离体空肠平滑肌的影响

文静 罗凯萍 方莹滢 吕远霞 周艳梅 李春臣 吴小桥 杨春妮 张建武

(川北医学院 1药学院，四川 南充 637100；2医学影像学院；3临床医学院)

桃金娘为桃金娘科植物桃金娘Rhodomyrtus tomentosa(Ait)Hassk.的干燥根，其果实、花、叶均可入药，具有养血、止血、涩肠、固精之功效。现代药理研究表明，桃金娘还具有抗氧化〔1〕、抗菌〔2〕、抗病毒〔3〕、降血糖〔4〕等作用，在医药、保健品和化妆品中具有广泛的应用价值。桃金娘因其收涩之性而具有涩肠固精之功效，临床可用于治疗慢性痢疾〔5〕。然而目前仅有少数报道桃金娘为一些药用食品和组合药物的药味之一，可用于治疗幼儿腹泻、病毒性细菌性感染腹泻及内服治疗慢性结肠炎，并未广泛应用于临床腹泻的治疗，其对胃肠道的作用及作用机制也鲜有报道。因此，本实验从离体和在体两个方面评估桃金娘在胃肠道方面的作用，为临床治疗腹泻提供新的研究方向。

1 材料与方法

1.1试剂与仪器

1.1.1试剂 95%乙醇、碳酸氢钠、氯化钾、葡萄糖、磷酸二氢钠、硫酸镁、无水氯化钙、氯化钠、氯化铁、氯化铝、醋酸钾(成都市科隆化学品有限公司)，纯化水(杭州娃哈哈集团有限公司)，乙酰胆碱(成都化夏化学试剂有限公司，纯度：99%，批号：2017032301)，维拉帕米(美国 MedChemExpress 生物科技公司，纯度：99.97%，批号：25193)，蓖麻油(河南省华龙药业有限公司，批号：20180407)，没食子酸(中国科学院成都生物研究所，批号：MUST-19032801，纯度：99.04%)，乙腈(Northscht，色谱纯)，生理盐水(浙江国镜药业有限公司，批号：H33020482)

台氏液制备：将氯化钠 40 g，氯化钾 1 g，氯化钙 1 g，二水合磷酸二氢钠 0.325 g，一水合葡萄糖 5.5 g，碳酸氢钠 5 g，七水合硫酸镁 1.3 g，溶于1 000 ml纯化水中，备用。

1.1.2实验仪器 Agilent-1220 高效液相色谱仪(Agilent，美国)，色谱柱(Aglient-ZORBAX SB-C18)，电子分析天平(Mettle AE 240)，旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂，RE-52AA)，真空减压干燥箱(武汉奥普森试验设备有限公司，ZK 6050B)，HW-400E恒温平滑肌槽，BL-420F生物机能实验系统，FT-100生物张力传感器(四川成都泰盟公司)，优普纯水/超纯水制造系统(四川优普超纯科技有限公司)，电热恒温鼓风干燥箱(YDYQ,101-2A)，粉碎机(天津市泰斯特仪器有限公司，FW177)，超声仪(东莞市柯桥超声设备有限公司，KQ-300DE)。

1.1.3药物的提取 桃金娘叶购于广西玉林市，经川北医学院药学院杨兰老师鉴定为桃金娘科植物桃金娘Rhodomyrtus tomentosa(Ait)Hassk.的叶。将自然风干的桃金娘叶用粉碎机粉碎成粗粉，精密称定100 g，置于1 L的圆底烧瓶中，加入10倍量95%乙醇(分析纯)，浸泡24 h，然后回流提取3次，每次3 h，合并滤液，旋转蒸发浓缩成浸膏，置于真空减压干燥箱中干燥，得桃金娘叶乙醇提取物(RText)，经计算浸出率为33.26%。提取物置于4℃冰箱中储存备用。

1.1.4实验动物 健康雄性昆明小鼠(体重18～22 g)和健康大白兔体重(2.0～2.5 kg)均购买于川北医学院实验动物中心〔许可证编号：SYXK(chuan)2018-076〕。将动物置于12 h光照黑暗循环条件下饲养，且将温度控制在23～26℃。饲养期间动物可以自由获取食物和水。本实验严格遵循动物伦理和实验准则。

1.2方法

1.2.1高效液相色谱法鉴定RT ext中的化学成分

1.2.1.1色谱条件 色谱柱Aglient-ZORBAX SB-C18(250 mm×4.6 mm,5 μm)，流动相为乙腈-0.1%甲酸水溶液，采用等度洗脱(流动相A为0.1%甲酸，流动相B为乙腈，80∶20)，波长为272 nm，流速为0.4 ml/min，柱温28℃,进样量为5 μl。

1.2.1.2对照品溶液制备 精密称定没食子酸对照品，加甲醇溶解，摇匀，制成每1 ml含0.1 mg的没食子酸对照品溶液，对照品溶液经0.22 μm微孔滤膜过滤后置于4℃冰箱冷藏备用。

1.2.1.3供试品溶液制备 精密称定RT ext 0.02 100 g，加甲醇溶解并定容至1 ml容量瓶中，摇匀，经0.22 μm微孔滤膜过滤，取续滤液作为供试品溶液。

1.2.2体内实验

1.2.2.1急性毒性实验〔6,7〕选取18～22 g健康雄性小鼠36只，随机分为6组，每组6只，分别灌胃0.5，1.0，2.0，4.0，8.0，16.0 g/kg的RT ext给各组小鼠，记录灌胃后14 d内的毒性迹象及死亡情况，小鼠在记录期间可自由进食饮水。以剂量为横坐标，死亡率为纵坐标建立剂量反应曲线确定其半数致死量(LD50)。采用单次给药最大剂量来评估RT ext的安全性。

1.2.2.2蓖麻油诱导的腹泻 本部分实验参照Guo等〔8〕及Tadesse等〔9〕的实验方法，先进行预实验，小鼠灌胃给予0.5 ml蓖麻油，筛选出表现为腹泻的小鼠50只，随机分为5组，每组10只。阴性对照组灌胃生理盐水(20 ml/kg)，阳性对照组灌胃维拉帕米(50 mg/kg)，RT ext按照低、中、高浓度灌胃给药，剂量分别为125、250和500 mg/kg。给药之后将每只小鼠单独放在事先准备的笼子中，并在笼子下垫吸墨纸，以便观察小鼠粪便情况。给药处理30 min后，各组小鼠灌胃给予蓖麻油(20 ml/kg)诱导腹泻。观察给予蓖麻油后4 h内的固体粪便、半固体粪便、液体粪便的数量及初始半固体粪便出现的时间，并用以下公式来判断腹泻程度。

排空指数=固体粪便数量×1+半固体粪便数量×2+液体粪便数量×3。

1.2.3体外实验

1.2.3.1离体标本的制备 选用健康家兔，实验前24 h作禁食(不禁水)处理，用木槌猛击家兔枕部致死，立即剖开腹腔，以幽门与十二指肠交界处为起始部取空肠部分。立即放入通有95% CO2和5% O2混合气体的台式液中，将肠内容物清洗干净并去除肠系膜，剪成1.5～2.0 cm的肠段，放入新鲜配制的台氏液中，并于恒温水浴箱(37℃±0.5℃)中保存，每隔10 min用台氏液换洗一次，保持标本活性。

1.2.3.2RT ext对离体空肠平滑肌自主收缩的影响 取一段肠管，一端用线结扎固定于通气沟，另一端连接张力换能器。平滑肌槽需保持恒温(37℃±0.5℃)，平滑肌槽中通入含95% CO2和5% O2的混合气体，将气泡速度调节为每秒钟1～2个，设置前负荷为1 g，稳定30 min后，依次累加RT ext〔0.01～10.00 mg(生药)/ml〕，每次加药时间间隔为200 s，另设阴性对照组和阳性对照组，阴性对照组间隔3 min加台氏液，阳性对照组间隔3 min累计加入维拉帕米(0.001～10.000 μmol/L)，采用BL-420F生物机能实验系统记录肠管的收缩情况，观察记录加药前后的平均值和最小值。

1.2.3.3RT ext对乙酰胆碱和氯化钾诱导的空肠平滑肌的影响 设备连接同1.2.3.2，待空肠平滑肌标本在肌槽中稳定30 min后，分别加入乙酰胆碱(10 μmol/L)和氯化钾(KCl，60 μmol/L)进行预处理，待出现最大波峰后立即用新鲜配制的台氏液反复冲洗直至基线恢复，之后再次加入同浓度乙酰胆碱和KCl预孵15 min，采用BL-420F生物机能实验系统记录空肠平滑肌的收缩曲线，然后再分别累加RT ext〔0.01～10.00 mg(生药)/ml〕和维拉帕米(0.001～3.000 μmol/L)，记录加药后平均值和最小值。

1.2.3.4RT ext对CaCl2诱导的空肠平滑肌的影响 为了进一步确定RT ext对Ca2+内流的影响，设计本实验。首先让肠管置于台氏液中进行平衡，待张力稳定后用含有乙二胺四乙酸(EDTA)的无钙高钾(60 mmol/L)的溶液替换台氏液30 min，以除去组织中的Ca2+。再换用不含EDTA的无钙高钾(60 mmol/L)溶液平衡15 min。然后加入RT ext构建CaCl2(3×10-5～3×10-2mol/L)的剂量-效应曲线，观察RT ext不同剂量对空肠平滑肌收缩率的影响。然后加入维拉帕米(1 μmol/L)，构建CaCl2(3×10-5～3×10-2mol/L)的剂量-效应曲线，观察空肠平滑肌收缩率的变化。在没有RT ext和维拉帕米存在的情况下3×10-2mol/L CaCl2诱导的收缩被认为是100%〔10〕。

1.3统计学分析 采用SPSS22.0软件进行方差分析、配对t检验。

2 结 果

2.1高效液相色谱法鉴别RT ext中的化学成分 RT ext中含没食子酸。在上述1.2.1.1的色谱条件下，没食子酸的分离度良好，空白、标准品、样品的色谱见图1。

图1 空白(A)、标准品(B)、RT ext样品(C)的HPLC色谱图(1没食子酸)

2.2体内实验

2.2.1急性毒性实验 RT ext 0.5，1.0，2.0，4.0，8.0，16.0 g/kg灌胃给药，在14 d观察期内未出现任何死亡或毒性迹象。在最大耐受量实验中，单次灌胃的RT ext的最高剂量为16 g/kg，而结果显示小鼠在观察期间没有出现任何死亡及身体行为的变化，可预估其LD50值大于16 g/kg。

2.2.2蓖麻油诱导的腹泻 与阴性对照组对比，维拉帕米组与RT低、中、高剂量组小鼠的半固体粪便产生时间显著延长(P<0.001)；与阴性对照组相比，阳性药维拉帕米组与RT低、中、高剂量组腹泻指数显著均下降(P<0.001，P<0.01)，RT中剂量作用明显(P<0.05)，RT低剂量有降低趋势，但与阴性对照组相比没有显著差异(P>0.05)。见表1。提示RT ext对蓖麻油诱导的腹泻有显著的抗腹泻活性，但其作用不及维拉帕米强。

表1 不同浓度RT ext对蓖麻油诱导小鼠腹泻模型的初始半固体出现时间及排空指数的影响

2.3体外实验

2.3.1RT ext对家兔离体空肠平滑肌自主收缩的影响 阴性对照组单加台氏液后空肠平滑肌自主收缩并未受影响(图2C)，RT ext可抑制兔空肠平滑肌的自主收缩，且呈浓度依赖性(图2A)，0.01、0.03、0.10、0.30、1.00、3.00、10.00 mg/ml RT平滑肌百分收缩率分别为：(94.50±1.67)%、(90.76±2.41)%、(84.67±4.09)、(76.53±3.52)%、(46.37±3.02)、(27.63±2.74)%、(7.56±2.55)%，其作用与维拉帕米组的效果相似(图2B)，0.01、0.03、0.30、1.00、3.00、10.00 μmol/L 维拉帕米平滑肌百分收缩率分别为(79.44±5.37)%、(87.44±2.97)%、(82.64±3.32)%、(69.70±2.33)%、(46.39±3.28)%、(21.25±3.35)%、(9.87±2.28)%，表现为平均收缩力下降，其EC50值分别为0.68 g/L 95%(CI：0.61～0.81 g/L，n=6)和0.57 μmol/L(95%CI：0.48～0.66 μmol/L，n=6)。

图2 不同浓度RT ext(A)、维拉帕米(B)及台式液(C)对兔离体空肠平滑肌自主收缩的影响(横坐标为时间，间隔200 s，纵坐标为平滑肌收缩幅度)

2.3.2RT ext对Ach和KCl诱导的空肠平滑肌的影响 RT ext能浓度依赖性的抑制由Ach诱导的肠管收缩，EC50为0.43 mg/ml(95%CI：0.35～0.53 mg/ml，n=6)，维拉帕米的EC50为0.39 μmol/L(95%CI：0.344 6～0.435 3 μmol/L，n=6)。此外，RT ext能浓度：依赖性地抑制由KCl诱导的肠管收缩，EC50为0.13 mg/ml(95%CI：0.11～0.17 mg/ml，n=6)，维拉帕米的EC50为0.064 μmol/L(95%CI：0.056～0.070 μmol/L，n=6)。见表2、表3。

表2 不同浓度的维拉帕米对Ach和KCl预处理后兔离体空肠平滑肌百分数收缩率的影响

表3 不同浓度的RT ext对Ach和KCl预处理后兔离体空肠平滑肌百分收缩率的影响

2.3.3RT ext对CaCl2诱导空肠平滑肌的收缩的影响 与CaCl2阴性对照组相比，RT ext 1 mg/ml和维拉帕米0.03 μmol/L可极显著降低累加CaCl23×10-4～3×10-2mol/L时平滑肌的收缩率(P<0.001)；RT ext 3.00 mg/ml维拉帕米0.1 μmol/L可显著降低累加CaCl21×10-4～3×10-2mol/L时平滑肌的收缩率(P<0.001,P<0.01)。RT ext可抑制CaCl2诱导的兔离体空肠平滑肌的手术，且呈剂量依赖性，其作用趋势和维拉帕米一致。见表4。

表4 CaCl2对兔离体空肠在无和有RT ext及维拉帕米情况下平滑肌收缩率的影响

4 讨 论

腹泻是一种常见的消化道疾病，临床多表现为肠黏膜的分泌旺盛与吸收障碍，胃肠蠕动加快，排便次数增多，粪质稀薄如同水样或含有异常成分等。长期腹泻可引起患者肠道正常菌群失调、营养不良、免疫力下降等〔11〕。据报道〔12〕，每年全球人群腹泻发生率约为5%，严重危害人类健康，目前已成为全球发展中国家突出的公共卫生问题。腹泻的致病因素较多，可由多种疾病引起，因此给临床治疗带来了一定的困难。中医药理论强调“整体观念”“辨证论治”，其“异病同治”的理论非常符合腹泻的治疗。中医学根据腹泻的便次频繁、粪质稀薄或完谷不化的症候特点将其归属于“泄泻”的范畴，其病名首见于《内经》，故中医药治疗腹泻已有非常悠久的历史。

据报道，任何5 g/kg无毒物质都是相对安全的〔13〕，而本研究的急性毒性实验结果表明，口服RT ext至16 g/kg不会产生任何毒性及死亡迹象，故认为RT ext口服安全性良好，为后续实验奠定基础。

蓖麻油是从蓖麻的种子中提取而来，蓖麻油本身并无致泻的作用，蓖麻油引起腹泻的原因主要是其皂化后可生成刺激性较强的蓖麻油酸钠，可促进炎症介质的合成与释放，引起小肠炎症，致使肠腔积液，从而引起急性腹泻。在蓖麻油诱导的小鼠腹泻实验中，RT ext 低、中、高剂量均可显著延长半固体粪便出现的时间，表明桃金娘具有抗腹泻活性。桃金娘的成熟果实中富含黄酮苷、酚类物质；根和树皮含有鞣质、生物碱等；叶的主要成分为桃金娘油，也富含黄酮苷、水解鞣质。已有研究证实桃金娘鞣质可通过抑制胃肠收缩运行或降低肠道蠕动、降低腹腔毛细血管和肠绒毛膜通透性、抑制炎症介质合成释放等机制产生抗腹泻作用〔14〕。也有报道显示，桃金娘4种酚类成分具有体外抗猪流行性腹泻病毒(PEDV)的药理活性,鞣花酸、白藜芦醇、没食子酸具有抗猪流行性腹泻病毒药物研究和开发价值〔15〕。而本研究也确定桃金娘中含有没食子酸。此外，黄酮类化合物可以抑制自体蛋白和前列腺素的释放〔16〕。因此推测，桃金娘的抗腹泻活性可能与其所含有的鞣质、酚类物质及黄酮类成分发挥的抗炎等作用有关。

本研究经结果显示，RT ext可以抑制空肠平滑肌的自主收缩，且呈浓度依赖性；RT ext对乙酰胆碱所致平滑肌收缩有显著的缓解作用，且呈浓度依赖性。本结果也进一步印证RT ext可以缓解蓖麻油诱导的小鼠腹泻这一现象。乙酰胆碱是肠神经系统中主要的兴奋性神经递质〔17〕，能激动M胆碱受体，M受体耦联G蛋白(GP)，使胞内第二信使三磷酸肌醇(IP3)和二酰基甘油(DG)浓度上升，进而引起Ca2+释放和底物蛋白磷酸化激发平滑肌产生收缩效应〔18〕。本实验结果显示RT ext能舒张乙酰胆碱诱导的空肠平滑肌收缩，作用趋势与阳性药维拉帕米一致，因此推测RT ext对空肠平滑肌自主收缩的抑制作用可能与阻断M受体有关。

平滑肌的收缩有赖于细胞质中游离钙的存在，阻断钙通道或是Ca2+释放减少都会减弱肠平滑肌的收缩。L-型钙通道是细胞兴奋过程中调节细胞内钙离子浓度保持在正常范围内的主要离子通道〔19〕。高浓度的K+可打开电压依赖性L型钙通道，允许外Ca2+内流，从而促进肠平滑肌的收缩〔20,21〕。而如果有物质能够松弛高K+诱导的肠平滑肌收缩则提示该物质可能为钙拮抗剂〔22〕。本实验结果显示，RT ext能松弛氯化钾诱导的肠平滑肌收缩，RT ext拮抗空肠平滑肌收缩的机制可能是通过非竞争性方式抑制外钙内流。

综上所述，RT ext具有显著抗腹泻的活性。且RT ext能浓度依赖性抑制离体兔空肠平滑肌的自主收缩，其作用机制可能与阻断M受体及L型钙离子通道有关。当然，RT ext对胃肠道的其他作用机制仍需要进一步研究。