黄芪总皂苷调控LKB1/AMPK信号通路对人乳腺癌细胞增殖、凋亡、周期的影响及机制

谭艳芳 张艳冰 万红霞 肖薇 赵友兰

(萍乡市人民医院 1甲状腺乳腺外科，江西 萍乡 337000；2药剂科)

乳腺癌是多发于女性乳腺上皮或导管上皮的恶性肿瘤〔1〕，是较为常见的侵袭性癌症〔2〕，其发病率在女性恶性肿瘤中占据首位〔3〕，对女性生命健康构成极大威胁〔4〕。当下，乳腺癌的临床治疗以手术切除治疗、药物靶向治疗、放疗、化疗为主，其中放化疗不良反应明显，常辅以中药材来缓解其产生的不良反应。近年来，研究人员将研究重点放在中药方面，部分中药材具有天然的抗癌、抑癌效果，从植物代谢产物中筛选和发掘新的化合物是开发低毒高效抗癌药物的重要途径〔5〕。目前，中药治疗乳腺癌在临床中被广泛应用〔6〕。黄芪总皂苷是于豆科植物蒙古黄芪的根中提取的，具有调控血糖、增强免疫、抗癌、抗氧化、改善炎症反应等多种作用〔7,8〕。有文献记录，黄芪总皂苷作用于人乳腺癌细胞后使大多数细胞诱导有丝分裂停滞和细胞凋亡，而存活细胞变得衰老，但其机制尚不可知。肝激酶(LK)B1是磷酸腺苷激活的蛋白激酶(AMPK)上游激酶〔9～11〕，研究证明，LKB1/AMPK信号通路能够影响癌细胞的增殖与凋亡。目前，对于黄芪总皂苷作用于乳腺癌的研究较少，其具体的作用机制也尚不清楚。本研究基于LKB1/AMPK信号通路探讨黄芪总皂苷对人类乳腺癌细胞增殖、凋亡及周期的影响及其作用机制。

1 材料与方法

1.1细胞、试剂、仪器 人乳腺癌细胞ZR-75-1；黄芪总皂苷；DMEM培养基；胎牛血清(FBS)；裂解液；试剂盒；聚合酶链反应(PCR)仪；酶标仪；显微镜；流式细胞仪。

1.2细胞培养 培养液中添加FBS，青、链霉素，于37℃、5%CO2中培养ZR-75-1细胞，0.25%胰蛋白酶细胞传代。

1.3人乳腺癌细胞ZR-75-1增殖抑制检测 取调整至5×106/ml浓度的ZR-75-1细胞，转移至96孔板中，每孔100 μl，等待24 h。加入100 μl浓度各异的培养液，使黄芪总皂苷浓度分别为0(对照组)、50(低剂量组)、100(中剂量组)、150(高剂量组)mg/μl，等待24 h，加噻唑蓝(MTT)液，无光环境下等待4 h，终止培养，去除培养基，每孔加二甲基亚砜(DMSO)150 μl，震荡10 min，酶标仪490 nm检测吸光度(A)，算抑制率。

1.4人乳腺癌细胞ZR-75-1凋亡情况 取人乳腺癌细胞ZR-75-1，药物作用24 h，收集细胞，用200 μl冷磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤细胞2次，收集细胞；加重悬细胞、膜联蛋白(Annexin)V-异硫氰酸荧光素(FITC)、碘化丙啶(PI)混匀，室温无光环境下静置10 min，检测。

1.5人乳腺癌细胞ZR-75-1细胞周期变化 取人乳腺癌细胞ZR-75-1，用不同浓度黄芪总皂苷作用24 h，消化，收取细胞，清洗2次，冷乙醇固定，4℃过夜，离心去乙醇，清洗，加入含RNaseA的 PBS 500 μl，再加入PI染色混匀，37℃无光环境下等待30 min，检测。

1.6人乳腺癌细胞ZR-75-1 LKB1、AMPK mRNA表达 采用不同浓度的黄芪总皂苷处理细胞48 h后，TRIZOL提取人乳腺癌细胞ZR-75-1总RNA进行逆转录，β-actin为内参，进行PCR检测。PCR扩增反应条件：95℃，10 s，60℃，40 s，共27个循环。并用公式进行定量分析：ΔCt =目的基因Ct-内参基因Ct。引物序列为：LKB1：正向5′-GAGATGGACTTATATGAGGACTAC-3′，反向5′-TTGCTGCTAACA-CTTGAGAC-3′；AMPK：正向5′-CCAGGGACCATGTTTTGCC-3′，反向5′-CGAAGACGACAAGATGGACAA-3′；β-actin：正向5′-GGCATCGTGATGGACTCCG-3′，反向5′-GCTGGAAGGTGGACAGCGA-3′。

1.7人乳腺癌细胞ZR-75-1 LKB1、AMPK蛋白表达 人乳腺癌细胞ZR-75-1药物作用24 h。终止细胞培养后，吸除培养液，PBS洗涤，冰浴裂解30 min，离心，得到总蛋白。二喹啉甲酸(BCA)测总蛋白，电泳后，移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜，封闭1 h，加抗体 LKB1、AMPK及β-actin，一抗4℃孵育过夜；清洗3次，5 min/次；加二抗，室温培养1 h，洗3次，每次10 min，无光环境下等待5 min，显影、扫描、分析。

1.8统计学分析 采用SPSS23.0软件进行F检验。

2 结 果

2.1各组ZR-75-1细胞增殖情况 乳腺癌细胞ZR-75-1的增殖受到黄芪总皂苷的影响，随黄芪总皂苷剂量攀升，癌细胞增殖抑制率逐渐增强，差异有统计学意义(P<0.05)，见表1。

2.2各组ZR-75-1细胞凋亡状况 乳腺癌细胞ZR-75-1的凋亡受到黄芪总皂苷影响，黄芪总皂苷剂量越大，乳腺癌细胞ZR-75-1的凋亡率越高，差异有统计学意义(P<0.05)，见表1、图1。

图1 各组ZR-75-1细胞凋亡

2.3各组ZR-75-1细胞周期波动 乳腺癌细胞ZR-75-1的细胞周期受黄芪总皂苷影响出现波动，随黄芪总皂苷剂量攀升，G0/G1期细胞比例明显增加，S期、G2期明显降低，见图2。

图2 各组ZR-75-1细胞周期波动

2.4各组ZR-75-1细胞LKB1、AMPK mRNA及蛋白表达 黄芪总皂苷作用下，乳腺癌细胞ZR-75-1 LKB1、AMPK mRNA及蛋白表达上升，黄芪总皂苷剂量越高，LKB1、AMPK mRNA及蛋白表达上升越明显，差异有统计学意义(P<0.05)，见表1、图3。

表1 各组ZR-75-1细胞增殖率、凋亡率及LKB1、AMPK mRNA与蛋白表达

1～4:对照组，黄芪总皂苷低剂量组，黄芪总皂苷中剂量组，黄芪总皂苷高剂量组图3 各组ZR-75-1细胞 LKB1、AMPK蛋白表达

3 讨 论

近年来乳腺癌的发病率在全球女性癌症中占榜首〔12〕。研究人员不断探索新的治疗方式，在此过程中，中药凭借其靶点众多、治疗效果明显、毒副作用小等优点脱颖而出，得到众多学者的关注。目前，已有多种中药如连翘归尾煎〔13〕、茯苓多糖〔14〕、莪术醇〔15〕等投入乳腺癌的治疗。黄芪总皂苷是我国传统中草药豆科植物蒙古黄芪的根的提取物，具有升阳、固表、补中益气的功效，能有效增强机体特异及非特异性免疫功能，同时也具有保肝、利尿、抗衰老、抗应激、降压和抗菌作用。相关研究指出，黄芪总皂苷对糖尿病、神经元退行性疾病及部分癌症具有较好的治疗效果，其机制主要与机体代谢及自噬有关〔16,17〕。

本研究结果发现，乳腺癌细胞ZR-75-1的增殖活力随黄芪总皂苷的剂量而改变，黄芪总皂苷的剂量越高，其对乳腺癌细胞ZR-75-1的增殖抑制作用就越强。流式术表明，乳腺癌细胞ZR-75-1的凋亡与黄芪总皂苷密切相关，黄芪总皂苷的剂量越高，人乳腺癌细胞ZR-75-1的细胞凋亡率就越高，其他研究也指出，黄芪总皂苷能抑制人胃癌BGC-823细胞生长,降低其侵袭能力,并可诱导细胞凋亡〔18〕。中药抑制癌细胞增殖的重要途径便是诱发癌细胞出现周期阻滞，本研究结果提示，黄芪总皂苷可能阻断了乳腺癌细胞ZR-75-1的细胞周期进程，诱导乳腺癌细胞ZR-75-1在G0/G1期阻滞，且黄芪总皂苷剂量越高，其变化就越明显。根据以上实验内容得知，黄芪总皂苷可能压制乳腺癌细胞ZR-75-1的增殖活性、推动乳腺癌细胞ZR-75-1自主走向凋亡，诱导乳腺癌细胞ZR-75-1于G0/G1 期阻滞，从而达到遏制肿瘤扩散的作用。

LKB1/AMPK信号通路是人体内健康细胞与肿瘤细胞的能量感知桥梁，其能够密切关注并感知细胞能量，此外，其还能够诱导代谢适应途径从而保证细胞的生存状态。一旦人体内出现缺氧或营养匮乏情况，细胞内一磷酸腺苷/三磷酸腺苷感知能量应激条件陡然升高，LKB1就会磷酸化激活AMPK、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶〔19,20〕。AMPK、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶被激活后，LKB1/AMPK信号通路中分解代谢产生三磷酸腺苷的过程会随之增加，如糖酵解和脂肪酸氧化，并抑制三磷酸腺苷消耗的生物合成过程，如蛋白质、胆固醇和脂肪酸合成。已有研究证明〔21〕，LKB1是确定的肿瘤抑制因子，最早是在非洲爪蟾胚胎发育研究中发现，它是经典Wnt信号传导下糖原合成酶激酶(GSK)-3β激活的负调节因子。TCS2被GSK-3β磷酸化后抑制雷帕霉素靶蛋白(mTOR)通路，在Wnt刺激后与AMPK协同。在敲除了LKB1基因的人宫颈癌HeLa细胞中，转染了LKB1基因的HeLa细胞的增殖活性大大减弱，显示出明显的抑制作用。AMPK是肿瘤抑制因子。体外细胞试验表明，将LKB1、AMPK过度转染于小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)，其贴壁的生长及体内实体肿瘤生长明显被抑制。此外，AMPK 已被证明对某些癌症中癌基因诱导的肿瘤发展和细胞增殖过程至关重要及 MEF和某些癌细胞系中的失巢凋亡抗性。在细胞迁移和侵袭期间，AMPK的药理学活化导致线粒体转运及腺嘌呤核苷三磷酸(ATP)含量和细胞骨架动力学的变化。LKB1/AMPK 信号传导途径的抑制培养条件是癌细胞存活和球状体迁移所必需的〔21,22〕。本研究发现，乳腺癌细胞ZR-75-1 LKB1、AMPK mRNA及蛋白的表达都在黄芪总皂苷的影响下发生了变化，随着黄芪总皂苷作用剂量的增加，LKB1、AMPK mRNA、蛋白表达对应增加，这与上述内容也相符合。

综上，黄芪总皂苷使人乳腺癌细胞ZR-75-1的增殖活力受到遏制，并诱导人乳腺癌细胞ZR-75-1凋亡并在细胞增殖周期G0/G1期中阻滞，这其中产生作用的机制通道与LKB1/AMPK信号通路密切相关，至于其中是否有其他作用机制尚不可知，需进一步实验证实。