间充质干细胞移植治疗缺血性脑卒中基础研究进展

孙楷航 巴特 王婧 郝婷 王琦 桑博默 赵晓峰

(1天津中医药大学第一附属医院，天津 300381；2国家中医针灸临床医学研究中心)

缺血性脑卒中(IS)是指因脑部血液循环障碍，缺血、缺氧所致的局限性脑组织缺血性坏死或软化。由于其高发病率、患病率、死亡率和致残率而成为造成全世界疾病负担的重要原因之一。临床治疗主要采用急性期溶栓及脑神经保护等措施减少脑组织功能损伤，针对组织损伤后的功能恢复缺乏理想手段。近年来，干细胞移植疗法被认为在IS治疗领域有独特的优势。干细胞具有自我更新、分化的能力，可分化为各类型组成神经系统所需的细胞，在损伤脑组织局部通过替代等作用恢复受损神经功能，发挥治疗作用。干细胞种类多样，其中间充质干细胞(MSCs)因其具有便于获取的广泛来源、低免疫原性及较好的安全性备受关注。

目前，多项临床试验已逐步开展。然而，一些多中心大样本临床试验结果显示干细胞移植未能达到理想临床疗效〔1,2〕，可能与移植策略的选择有关。干细胞移植过程复杂，选择不同干细胞来源、移植途径、移植时间、移植剂量参数均会影响移植效果，本文由临床回归基础实验，探讨MSCs移植的疗效、机制、操作参数、增效策略等方面，对近年来研究成果进行综述，以期推动干细胞疗法的临床转化。

1 MSCs移植的疗效与机制

大量研究表明，MSCs移植在IS动物模型中疗效明显，主要依据行为学、组织学方面的改善情况进行评价〔3～6〕。在行为学方面，常采用移除黏附物能力测试评价自体感觉缺失情况、转轴测试评价运动功能、肢体放置测试评价运动感觉完整性、平衡木行走测试评价大鼠的运动协调功能及神经功能损伤评分评价神经功能缺损程度等，相关实验显示MSCs移植后可见神经功能改善明显〔3,5,6〕；在组织学方面，通过磁共振成像或TTC染色观察脑梗死体积，各项研究中MSCs治疗组与模型组对比常可见梗死体积明显缩小〔3,4〕。

MSCs移植通过多种机制改善神经功能，减少脑神经损伤。研究表明MSCs治疗机制主要涉及几个方面：(1)免疫调节：移植的MSCs可介导免疫抑制作用〔7〕，通过缺氧环境下干细胞高表达的一种抗炎因子CD200调节炎症细胞因子和小胶质细胞活化水平〔8〕，另通过减少小胶质细胞/巨噬细胞的数量〔9〕，或诱导小胶质细胞向抑制炎症反应的M2型极化〔10〕，从而减轻脑卒中大鼠的神经损伤。(2)细胞凋亡：钙调磷酸酶是一种苏氨酸/磷酸酶，在神经稳态中起重要作用，IS诱导钙调磷酸酶的过度激活进而触发凋亡信号，MSCs移植可通过降低神经元钙调磷酸酶表达，抑制细胞凋亡〔11〕。干细胞移植也可通过抑制炎症减少继发性细胞死亡〔12〕。(3)神经元损伤：神经元损伤可由多种机制引起，钙超载、氧化应激等机制在IS引起的神经元损伤中起重要作用。移植的MSCs可通过上调主要定位于高尔基体的钙泵SPCA1的表达减轻钙超载〔13〕，通过上调一种抗氧化酶UBIAD1来减少线粒体功能障碍和增强抗氧化作用〔14〕，另外，MSCs通过影响损伤后蛋白清除途径，抑制泛素-蛋白酶体途径向自噬途径转化〔15〕，起到限制神经元损伤的作用。(4)神经营养：MSCs可诱导脑源性神经营养因子(BDNF)、神经生长因子〔16〕、血管内皮生长因子(VEGF)、肝细胞生长因子〔17〕等细胞因子的表达，营养神经，提高梗死区神经元存活率，促进神经保护作用发挥。(5)内源性神经发生：移植的MSCs可通过增加趋化因子、多聚唾液酸酶的表达，增加内源性神经祖细胞迁移〔18〕，可促进内源性少突胶质祖细胞增殖，促进髓鞘形成〔19〕，可触发神经细胞形成、增强神经元功能〔20〕，可下调抑制轴突生长、神经元再生的抑制因子Nogo-A等〔21〕促进神经发生。(6)分化替代：移植的MSCs可向神经细胞转化〔16〕，可能替代、补充受损的神经细胞恢复神经功能。(7)促进血管再生：移植的MSCs可通过向微血管宿主细胞转移功能完整的线粒体，改善大脑微血管线粒体功能，促进血管生成〔22〕，通过诱导血管生成〔23〕，改善脑血流循环，促进神经组织修复。(8)血脑屏障：移植的MSCs可通过腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)通路下调内皮细胞的细胞间黏附分子-1，减少中性粒细胞浸润，抑制基质金属蛋白酶-9的上升，减少血脑屏障破坏〔24〕。(9)功能连接：移植的MSCs可通过增强胼胝体在两侧大脑运动皮层间解剖学连接，促进神经功能恢复〔25〕。

2 MSCs移植相关参数

2.1干细胞来源 MSCs来源广泛，主要存在于结缔组织和器官间质中，可从多种组织中提取培养，根据其组织来源不同，分为骨髓源MSCs(BM-MSCs)、脂肪源MSCs(AD-MSCs)、脐带源MSCs(UC-MSCs)、脐血源MSCs、牙髓源MSCs、牙周膜源MSCs、嗅黏膜源MSCs等，根据供体不同，又可分为自体移植MSCs、同种异体MSCs、异种MSCs。是否自体移植、干细胞来源于供体的部位及供体生理病理状态，均可对MSCs疗效产生影响。对于同为异体来源的干细胞，供体的种属不论同种、异种对疗效影响不大，Gutiérrez-Fernández等〔26〕研究显示同种异体(大鼠)与异种(人)来源AD-MSCs在促进功能恢复和减少缺血性脑损伤方面表现出相同的效果。然而是否为自体移植则会对疗效产生明显影响，Yu等〔27〕研究表明，自体来源AD-MSCs与同种异体AD-MSCs相比，在体内有更好的生存能力、迁移能力和分化潜能及有更低的凋亡率，更能促进大鼠功能恢复，减少梗死体积。干细胞来源于供体的部位也会影响其疗效，Ikegame等〔28〕比较AD-MSCs与BM-MSCs，发现AD-MSCs除获取更简单安全外，在分泌VEGF等细胞因子，减少脑梗死、水肿面积，减少神经损害等方面也有明显优势。Abiko等〔29〕则认为颅骨源BM-MSCs比髂骨源BM-MSCs表达更多BDNF和神经生长因子，并引起更好的功能恢复作用。比较成人甚至老年人牙齿中最常见的牙髓源与牙周膜源干细胞，Wu等〔30〕认为牙周膜源MSCs更能促进神经功能恢复，可作为临床应用的理想候选细胞。关于供体生理、病理状态对移植疗效的影响，供体年龄是一个影响因素，Yamaguchi等〔31〕对人MSCs的研究表明，来源于年轻供体的MSCs移植组有更好的神经恢复和脑萎缩预防作用。然而，供体是否存在脑缺血可能不会对干细胞疗效产生影响，Tsai等〔32〕比较来自脑缺血大鼠与正常大鼠BM-MSCs的作用，结果发现两种来源干细胞治疗效果无明显差别。

2.2移植途径 MSCs可经多种途径移植进入体内，其中较为常见的有颅内〔10〕、动脉〔11〕、静脉〔25〕、鞘内移植〔33〕，也有实验通过鼻内注射〔4〕给药。由于注射方式不同，产生的治疗效果存在差异。大部分研究表明，动脉注射方式相较于其他方式，可见更为明显的疗效，Zhang等〔34〕将BM-MSCs通过动脉内、静脉内、脑内(3×106、3×106、5×105)三种方式给药，三种方式均明显改善神经功能，其中动脉注射组改善最迅速且最明显，并明显增强梗死侧胼胝体区髓鞘的重建。Shim等〔35〕通过鼠颈动脉、尾静脉注射(各2×105)经超顺磁氧化铁标记的MSCs，磁共振成像活体示踪MSCs分布，结果显示两组干细胞均可见于梗死灶周围，而动脉移植组在注射后早期有更多聚集。Du等〔36〕同样以颈动脉、尾静脉为注射途径(各2×106)注射人BM-MSCs(hBM-MSCs)，发现动脉注射安全且具有更好的治疗效果，可绕过肺系统更有效地将细胞导向大脑的缺血部位。治疗后大鼠大脑的功能、灌注和代谢得到改善，提示经动脉注射hBM-MSCs治疗可能是治疗脑卒中的合适方法。然而也有研究表明动脉注射与静脉注射相比有可能增加脑损伤的风险，且未能明显改善神经功能〔37〕。比较颅内注射与静脉注射方式，Noh等〔38〕研究结果表明，卒中亚急性阶段或慢性阶段静脉注射人VC-MSCs(hUC-MSCs)疗效甚微，颅内注射方式则可表现出明显疗效。关于鞘内注射，Lim等〔33〕对比鞘内注射与尾静脉注射hUC-MSCs，较高注射剂量(1×106)时两组均显著改善运动功能并减少了缺血性损伤，两组无统计学差异，而在较低剂量注射时(5×105)鞘内注射组细胞存活并更广泛地迁移到缺血区域，分化为神经元和星形胶质细胞，显著减少了缺血性损伤，而静脉注射组没有，所以可见相较于静脉注射，鞘内注射产生疗效对剂量的需求更低。目前，何种途径为既安全又有效的最适移植途径，还需进一步实验探索。

2.3移植时间 造模后干细胞移植时间点不同会影响干细胞分布、脑组织修复和神经功能恢复情况。Wang等〔39〕认为BM-MSCs在3 h、24 h移植而不是7 d时移植可显著减少病变体积，改善运动功能。Toyoshima等〔40〕研究表明与1、6、48 h组相比，24 h组改善改良大鼠神经功能缺损评分与梗死体积效果最明显，伴随有干细胞存活率高、迁移能力强的特点。Nam等〔41〕实验则表明，比较hBM-MSCs(2×106)于造模后1 h、1 d、3 d移植，超早期移植(1 h)能产生更明显的神经恢复和减少梗死体积作用。Lee等〔42〕比较1 d、4 d、7 d移植，结果表明早期MSCs移植(1 d)与更好的功能恢复相关，这可能与早期移植组MSCs优先向皮质迁移有关。Kawabori等〔43〕研究在1 w或4 w进行BM-MSCs颅内立体定位移植，1 w时低剂量移植与高剂量移植均引起显著功能恢复，而4 w时只有高剂量移植引起明显的治疗效果，表明早期移植只需要较少的干细胞即可产生有益的效果。Ishizaka等〔44〕于1 d、4 d、7 d颈动脉移植人MSCs，观察干细胞分布，结果1 d组干细胞分布于梗死核心及周围，4 d组分布于梗死灶周围，7 d组则观察到很少的细胞，表现出依赖于移植时间的细胞分布和卒中后功能恢复差异。由此可见，早期移植疗效较优，多数研究表明造模后24 h移植疗效最佳，然而也存在实验结果表明相对于24 h移植，更早移植(1 h)〔41〕或更晚移植(7 d)〔45〕可产生更好效果，实验结果差异可能由于选用的干细胞来源、移植剂量等其他因素不同所致，确定最适移植时间点还需细化影响因素设计实验来进一步研究。另外，Komatsu等〔46〕于7 d、14 d、28 d静脉注射MSCs，虽然显示早期(7 d)治疗可更明显的限制脑损伤体积，然而脑缺血1个月(28 d)后给予MSCs仍可发挥有益作用，可能与其促进血管生成有关，表明MSCs应用于永久性大脑中动脉阻塞模型改善功能预后的治疗时间窗至少为1个月。

2.4注射剂量及注射安全性 在一定范围内提高MSCs注射剂量有助于提高治疗效果，但超过一定剂量则会引起相关不良反应，影响MSCs移植安全性。以动脉注射为例，大剂量注射有可能引起细胞造成栓塞的危险。Fukuda等〔47〕比较低剂量(1×104)、高剂量(1×106)动脉注射人MSCs的有效性及安全性，结果虽然高剂量组MSCs在大鼠皮层和纹状体中分布较广，但血管内细胞聚集程度和大鼠死亡率明显较高，相比之下低剂量减少了栓塞并发症的副作用，且足以产生抗炎作用并使脑卒中后功能恢复。Yavagal等〔48〕比较5×104、1×105、2×105、5×105、1×106的动脉注射剂量，通过测量与造模、注射同侧的大脑中动脉上平均激光多普勒血流信号变化百分比确定最大耐受剂量，结果表明1×105时不影响大脑中动脉流量，被认为是最大耐受剂量，且24 h而不是1 h时注射可显著提高神经缺损评分，降低平均梗死体积。对于静脉注射途径的研究，He等〔49〕分低(5×104)、中(5×105)、高(2×106)剂量组注射BM-MSCs，中、高剂量均明显缩小了梗死体积，增大了软脑膜血管和基底动脉的直径，增加了大脑皮层梗死周围区毛细血管面积，提高了梗死周围区碱性成纤维细胞生长因子的表达及血清VEGF水平，所以结合安全性考虑可选择其中疗效相似的较小剂量5×105作为干细胞移植的适当剂量。关于血管内注射引起的血管阻塞，除受注射剂量影响外，注射细胞大小也是导致血管阻塞和中风的重要原因。Ge等〔50〕认为使用较小直径的MSCs可能增加血管内移植的安全性。另外注射速度也是影响移植安全性的因素，Janowski等〔51〕实验显示，注射速度超过1 ml/min常可引发脑卒中。

3 MSCs移植其他策略

干细胞在临床应用中显示有很好的应用前景，但没有表现出稳定的临床疗效，为增强疗效提高临床应用价值，大量基础实验对移植策略进行改良。干细胞靶向迁移能力差、植入率低制约了其治疗效果。通过各种方式，增强细胞存活、迁移、增殖、分化，促进归巢，诱导营养因子释放，可进一步改善缺血局部神经损伤，促进神经功能恢复。

3.1细胞预处理 部分实验在制备干细胞制剂时对干细胞进行注射前预处理，改变细胞部分特性，从而提高干细胞移植疗效。Hu等〔52〕研究表明，缺氧预处理增加BM-MSCs的趋化因子受体(CXCR)4表达，促进移植后细胞向梗死区周围归巢，抑制细胞凋亡，促进神经元的再生和功能恢复。Li等〔53〕以川芎提取物四甲基吡嗪预处理方式增强了BM-MSCs迁移和归巢能力，促进血管生成，改善神经功能。Sun等〔54〕使用一种挥发性麻醉剂异氟醚预处理干细胞，通过诱导缺氧诱导因子-1、CXCR4表达，增加BM-MSCs存活率和功能，提高向缺血脑组织内归巢能力，促进脑卒中小鼠的功能恢复。Yamauchi等〔55〕以血小板裂解液、粒细胞集落刺激因子进行干细胞预处理，处理后干细胞表现出更强的增殖能力。Hou等〔56〕实验表明在大鼠脑卒中模型中，与单纯使用hBM-MSCs相比，白细胞介素-8刺激hBM-MSCs中VEGF的生成，使用白细胞介素-8预处理的hBM-MSCs可降低缺血边界区梗死体积，增加血管新生。

3.2细胞改造 通过基因转导等手段，对细胞进行改造，可促进干细胞发挥治疗作用。Huang等〔57〕将趋化因子受体CCR2基因转导至MSCs，使CCR2在MSCs过表达，增强了干细胞向缺血半球的定向迁移，提高治疗效果。Zong等〔58〕通过腺病毒介导VEGF基因转染BM-MSCs，将干细胞移植到大鼠缺血大脑局灶区后，VEGF和BDNF的表达和分泌增加，微管相关蛋白2水平升高，微血管密度增加，大鼠行为功能改善，BM-MSCs存活率提高。Zhang等〔59〕移植BDNF转染的BM-MSCs后，与未转染组相比表现出更好的神经功能改善。

3.3联合干预 在干细胞移植治疗的同时，选择联合其他干预措施协同治疗，可通过辅助干细胞起效机制发挥作用，或同时整合干预措施本身的治疗效果，是一种综合提高疗效的策略。Morimoto等〔60〕在干细胞移植后使用电刺激器刺激右侧额叶硬膜外间隙，结果显示大鼠移植BM-MSCs的迁移能力增强，脑梗死体积减少，行为改善明显。Kim等〔61〕通过MSCs移植联合百会、大椎穴电针，两种干预都是神经营养因子的刺激因子，可促进BDNF、神经营养因子4等因子的表达，这些神经营养因子与缺血脑的神经发生有关，实验结果联合疗法比单一治疗更好地调节神经发生引起更明显的神经功能改善。Kim等〔62〕实验表明当归提取物协同MSCs可通过增强血管新生提高治疗作用，这种混合应用方式为治疗包括脑卒中、创伤和脊髓损伤在内的多种疾病提供了新的方案。Choi等〔63〕认为血脑屏障是限制干细胞疗效的重要结构，体外实验表明替莫唑胺、甘露醇联合使用可增加血脑屏障通透性，因此在脑卒中模型造模28 d后使用替莫唑胺、甘露醇联合hUC-MSCs移植，结果证实对慢性脑卒中大鼠模型联合应用比hUC-MSCs单独应用治疗更有效，可改善大鼠行为缺陷。虽然在两组大鼠脑内均未检测到hUC-MSCs，但与单纯使用干细胞治疗相比，联合使用干细胞、甘露醇、替莫唑胺可增加干细胞产生微囊泡的脑内递送，以此促进神经再生和血管生成来减少行为缺陷。

综上，大量基础实验证明MSCs移植疗法在IS应用中的可行性、有效性，并从多种机制阐述了其作用机制。然而，由于干细胞移植过程较为复杂，可供选择的移植参数众多，何种方式移植可以在保证安全性的前提下使干细胞移植达到最佳疗效，且消耗较少的干细胞资源，是当前仍需解决的重要问题。这个问题影响着临床试验的设计，掌握高效的干细胞移植策略成为临床应用推广的一个重要前提。由于移植参数多样复杂，干细胞来源、移植剂量、移植途径、移植时间等各方面的选择均会影响治疗的有效性及安全性，为确定最佳移植方式，未来还需大量系统、巧妙、合理设计的实验和后期大样本重复的实验验证。另外机制的探讨、挖掘有助于在常规干细胞移植方法基础上改良策略。联合疗法、预处理、细胞改造等方式可通过干预干细胞治疗机制，提高治疗有效性，降低不良事件发生，为IS治疗提供新的有效方案。总之，MSCs移植疗法在IS临床应用中前景广阔，相信不久的将来会在临床中体现出不可替代的作用。