SNHG3调控miR-186对过氧化氢处理的血管内皮细胞损伤的影响

郑 婉 林 云 左 琦 林燕仔 颜亚妮 符碧薇

（海南医学院第一附属医院心血管内科，海口 570102）

血管内皮细胞是组织和血液的直接屏障，血管内皮细胞损伤是动脉粥样硬化等心脑血管疾病发生的重要原因，因此，保护血管内皮细胞免受损伤对防治动脉粥样硬化起重要作用［1］。研究发现，lnc-RNA 异常表达参与调控动脉粥样硬化进展，有望成为心血管疾病的新型诊断标志物或药物治疗靶点［2］。研究报道，小核仁RNA 宿主基因3（small nu‐cleolar RNA host gene 3，SNHG3）参与多种恶性肿瘤发生发展，如SNHG3 高表达与卵巢癌不良预后相关，且促进卵巢癌细胞增殖、侵袭及恶性进展［3］。SNHG3 过表达与患者总体生存和无转移生存的不良预后相关，促进胃癌细胞迁移、侵袭及肺转移［4］。研究表明，miRNA 参与调节细胞增殖、分化、凋亡等功能，通过调控血管内皮细胞、血管平滑肌细胞参与动脉粥样硬化等心血管疾病过程［5-6］。miR-186在高危患者血清中高表达，可反映动脉粥样硬化性心血管疾病严重程度［7］。miR-186 通过抑制胱硫醚-γ-裂解酶表达降低内源性H2S 含量，促进巨噬细胞脂质蓄积和促炎因子分泌，可能与动脉粥样硬化有关［8］。抑制miR-186表达通过上调缺氧诱导因子-1α（hypoxia-inducible factor-1α，HIF-α）减轻缺氧状态下血管内皮细胞线粒体损伤［9］。但SNHG3 对血管内皮细胞损伤的影响及机制尚不清楚，本研究采用过氧化氢处理人脐静脉内皮细胞Eahy926建立血管内皮细胞损伤模型，探究SNHG3对血管内皮细胞损伤的影响及其机制是否与miR-186有关。

1 材料与方法

1.1 材料 人脐静脉内皮细胞株Eahy926（上海信裕生物科技有限公司）；DMEM 培养基（美国Sigma公司）；荧光定量试剂盒（美国Progema 公司）；RIPA蛋白裂解液（上海碧云天生物技术有限公司）；四甲基偶氮唑盐比色法（methyl thiazolyl tetrazolium assay，MTT）试剂盒、凋亡试剂盒、双荧光素酶报告基因检测试剂盒（北京索莱宝科技有限公司）；超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）试剂盒、乳酸脱氢酶（lactic dehydrogenase，LDH）试剂盒（南京建成生物工程研究所）；重组Anti-CyclinD1 抗体（ab134175）、重组Anti-P21 抗体（ab109520）、重组Anti-Bax 抗体（ab32503）、重组Anti-Bcl-2 抗体（ab182858）、山羊抗兔IgG H&L（HRP，ab6721，美国Abcam 公司）；PowerPac 蛋白电泳仪、Gel Doc XR+凝胶显示系统（美国Bio-Rad公司）。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养与分组 Eahy926 细胞采用含10%胎牛血清的DMEM 完全培养液于37 ℃培养，80% 融和时采用无血清培养基饥饿培养12 h，500 mmol/L过氧化氢培养细胞24 h作为过氧化氢组（H2O2），正常培养的细胞作为对照组。将pcDNA-3.1、pcDNA3.1-SNHG3 转染至Eahy926 细胞，再采用500 mmol/L过氧化氢处理，记为H2O2+pcDNA3.1组、H2O2+pcDNA3.1-SNHG3 组。将pcDNA3.1-SNHG3与miR-NC、miR-186 分别共转染至Eahy926 细胞，再采用500 mmol/L H2O2处理，记为H2O2+pc-DNA3.1-SNHG3+miR-NC 组、H2O2+pcDNA3.1-SNHG3+miR-186组。

1.2.2 RT-qPCR 检测SNHG3 和miR-186 表达 提取细胞总RNA，反转录为cDNA，按荧光定量PCR 试剂盒说明操作，循环条件为95 ℃预变性5 min，95 ℃变性20 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共40 个循环，2−ΔΔCt法计算相对表达。SNHG3 和miR-186 分别以GAPDH 和U6 为内参，SNGH3 正向引物：5'-GACTTCCGGGCACTTCGTAA-3'，反向引物：5'-TCCTTAACAAATCCAAGGAGAAGAA-3'；miR-186 正向引物：5'-GCCGAGCAAAGAATTCTCCTTT-3'，反向引物：5'-CTCAACTGGTGTCGTGGA-3'；GAPDH 正向引物：5'-TCCCATCACCATCTTCCAGG-3'，反向引物：5'-GATGACCCTTTTGGCTCCC-3'；U6 正向引物：5'-CTCGCTTCGGCAGCACATATACT-3'，反向引物：5'-ACGCTTCACGAATTTGCGTGTC-3'。

1.2.3 Western blot 检测细胞CyclinD1、P21、Bax、Bcl-2蛋白表达 提取细胞总蛋白，定量，电泳，转至PVDF 膜，封闭，加入一抗孵育过夜，加入二抗孵育2 h，曝光显影、定影，测定蛋白条带灰度值，以目的条带和GAPDH条带比值作为蛋白表达。

1.2.4 MTT 检测细胞存活率 收集各组对数生长期细胞于96 孔板培养48 h，去上清，加入新鲜培养液及10 µl MTT 培养液继续培养4 h，酶标仪检测490 nm 处吸光度（OD）值，细胞存活率（%）=OD实验组/OD空白对照组×100%。

1.2.5 SOD 和LDH 试剂盒分别检测细胞SOD 活性和培养液LDH 含量 细胞培养48 h 后收集各组细胞及培养上清，在细胞沉淀中加入PBS缓冲液，进行冰水浴（300 W，超声3~5 s/次，间隔4 次，每次间隔30 s）。采用考马斯亮蓝试剂盒测定蛋白浓度，按试剂盒说明书加入相应试剂，混匀，37 ℃孵育20 min，酶标仪测定450 nm处吸光度，计算SOD活力或LDH含量。

1.2.6 流式细胞术检测细胞凋亡 收集细胞，1×结合缓冲液悬浮细胞，调节细胞浓度为1×106~5×106个/ml，取100 µl 细胞悬浮液于流式管，加入5 µl Annexin Ⅴ/FITC 混匀，室温避光孵育5 min，加入5 µl PI，并加入400 µl PBS，流式细胞仪检测，细胞凋亡率（%）=早期和晚期凋亡细胞数/总细胞数×100%。

1.2.7 荧光素酶报告实验检测SNHG3 对miR-186的靶向调控 构建野生型和突变型SNHG3 的荧光素酶表达载体WT-SNHG3 和MUT-SNHG3，分别与miR-NC 和miR-186 共转染至Eahy926 细胞，充分裂解细胞后加至培养板，配制萤火虫荧光素酶反应工作液和海肾荧光素酶反应液，并孵育至室温，加入100µl 萤火虫荧光素酶反应液振荡混匀，检测萤火虫荧光素酶活力，加入100µl 海肾荧光素酶反应液振荡混匀，检测海肾荧光素酶活力。将pcDNA3.1、pcDNA3.1-SNHG3、si-NC、si-SNHG3 分别转染至正常Eahy926细胞，按1.2.2检测miR-186表达。

1.3 统计学分析 采用SPSS20.0软件进行统计学分析。计量资料以±s表示，两组间比较行t检验，多组间比较采用单因素方差分析，P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 H2O2处理的Eahy926 细胞SNHG3 表达 与对照组相比，H2O2处理的Eahy926 细胞SNHG3 表达比未采用处理H2O2处理的Eahy926 细胞显著降低（0.23±0.02vs1.01±0.10，t=22.946，P<0.001）。

2.2 过表达SNHG3 对H2O2处理的Eahy926 细胞活性及SOD、LDH 的影响 与对照组相比，H2O2处理的Eahy926 细胞SNHG3、CyclinD1 表达显著降低，P21 表达显著升高，存活率显著降低，SOD 活性显著降低，LDH 水平显著升高（P<0.05）；与H2O2+pcDNA 3.1 组相比，H2O2+pcDNA3.1-SNHG3 组Eahy926 细胞SNHG3、CyclinD1 表达显著升高，P21 表达显著降低，存活率显著升高，SOD 活性显著升高，LDH 水平显著降低（P<0.05，表1、图1）。

表1 过表达SNHG3对H2O2处理的Eahy926细胞活性及SOD、LDH的影响（±s，n=9）Tab.1 Effect of overexpression of SNHG3 on cell viability and SOD and LDH of Eahy926 cells treated with H2O2（±s，n=9）

表1 过表达SNHG3对H2O2处理的Eahy926细胞活性及SOD、LDH的影响（±s，n=9）Tab.1 Effect of overexpression of SNHG3 on cell viability and SOD and LDH of Eahy926 cells treated with H2O2（±s，n=9）

Note：Compared with control group，1）P<0.05；compared with H2O2+pcDNA3.1 group，2）P<0.05.

LDH/（U·L−1）468.26±53.50 1 468.11±140.281）1 454.57±139.31 661.25±73.842）208.246<0.001 Groups Control H2O2 H2O2+pcDNA3.1 H2O2+pcDNA3.1-SNHG3 F P SNHG3 1.02±0.10 0.24±0.021）0.22±0.02 0.71±0.072）345.076<0.001 CyclinD1 0.67±0.07 0.17±0.021）0.19±0.02 0.50±0.052）261.476<0.001 P21 0.20±0.02 0.78±0.081）0.75±0.07 0.34±0.032）243.119<0.001 Survival rate（%）100.07±8.25 42.28±4.131）42.61±4.25 88.27±6.822）220.061<0.001 SOD/（U·mg−1·prot−1）32.18±2.96 17.06±1.621）16.94±1.57 28.29±2.612）106.125<0.001

图1 过表达SNHG3对H2O2处理的Eahy926细胞增殖相关蛋白表达的影响Fig.1 Effect of overexpression of SNHG3 on proliferation related proteins expressions in H2O2-treated Eahy-926 cells

2.3 过表达SNHG3 对H2O2处理的Eahy926 细胞凋亡的影响 与对照组相比，H2O2处理的Eahy926 细胞Bax 表达显著升高，Bcl-2 表达显著降低，细胞凋亡率显著升高（P<0.05）；与H2O2+pcDNA3.1 组相比，H2O2+pcDNA3.1-SNHG3 组Eahy926 细胞Bax 表达显著降低，Bcl-2 表达显著升高，细胞凋亡率显著降低（P<0.05，图2、表2）。

图2 过表达SNHG3 对H2O2 处理的Eahy926 细胞凋亡的影响Fig.2 Effect of overexpression of SNHG3 on apoptosis of Eahy926 cells treated with H2O2

表2 过表达SNHG3 对H2O2 处理的细胞Eahy926 凋亡的影响（±s，n=9）Tab.2 Effect of overexpression of SNHG3 on apoptosis of Eahy926 cells treated with H2O2（±s，n=9）

表2 过表达SNHG3 对H2O2 处理的细胞Eahy926 凋亡的影响（±s，n=9）Tab.2 Effect of overexpression of SNHG3 on apoptosis of Eahy926 cells treated with H2O2（±s，n=9）

Note：Compared with control group，1）P<0.05；compared with H2O2+pcDNA3.1 group，2）P<0.05.

Groups Control H2O2 H2O2+pcDNA3.1 H2O2+pcDNA3.1-SNHG3 Bax 0.13±0.01 0.71±0.071）0.70±0.07 0.25±0.022）Bcl-2 0.81±0.08 0.25±0.021）0.27±0.03 0.65±0.072）Apoptosis rate（%）8.01±1.10 26.66±2.751）26.19±2.53 14.04±1.382）179.497<0.001 F P 317.447<0.001 222.762<0.001

2.4 SNHG3 靶向调控miR-186 表达 starbase 预测显示，SNHG3 与miR-186 存在结合位点（图3）。miR-186 与WT-SNHG3 共转染的Eahy926 细胞荧光素酶活性显著降低（P<0.05），而与MUT-SNHG3 共转染的Eahy926细胞荧光素酶活性差异无统计学意义（P>0.05，表3）。相较于pcDNA3.1 组，pcDNA 3.1-SNHG3 组miR-186 表达显著降低，相较于si-NC组，si-SNHG3 组miR-186 表达显著升高（P<0.05，表4）。提示SNHG3可靶向调控miR-186表达。

表3 双荧光素酶实验（±s，n=9）Tab.3 Dual luciferase experiment（±s，n=9）

表3 双荧光素酶实验（±s，n=9）Tab.3 Dual luciferase experiment（±s，n=9）

Note：Compared with miR-NC group，1）P<0.05.

MUT-SNHG3 0.95±0.10 1.02±0.10 1.485>0.05 Groups miR-NC miR-186 t P WT-SNHG3 1.00±0.10 0.37±0.041）17.548<0.001

表4 SNHG3调控miR-186表达（±s，n=9）Tab.4 SNHG3 regulates expression of miR-186（±s，n=9）

表4 SNHG3调控miR-186表达（±s，n=9）Tab.4 SNHG3 regulates expression of miR-186（±s，n=9）

Note：Compared with pcDNA3.1 group，1）P<0.05；compared with si-NC group，2）P<0.05.

miR-186 0.98±0.10 0.33±0.031）0.95±0.10 1.66±0.162）228.594<0.001 Groups pcDNA3.1 pcDNA3.1-SNHG3 si-NC si-SNHG3 F P

2.5 过表达miR-186 可逆转SNHG3 对H2O2处理的Eahy926 细胞活性及SOD、LDH 的影响 与H2O2+pcDNA3.1-SNHG3+miR-NC 组相比，H2O2+pcDNA-3.1-SNHG3+miR-186 组Eahy926 细胞miR-186、CyclinD1 表达显著降低，P21 表达显著升高，细胞存活率显著降低，SOD 活性显著降低，LDH 水平显著升高（P<0.05，图4、表5）。

图4 过表达miR-186 逆转SNHG3 对H2O2处理的Eahy926细胞增殖相关蛋白表达的影响Fig.4 Overexpression of miR-186 reverses effect of SNHG3 on expressions of proliferation related proteins in H2O2 treated Eahy926 cells

表5 过表达miR-186可逆转SNHG3对H2O2处理的Eahy926细胞活性及SOD、LDH的影响（±s，n=9）Tab.5 Overexpression of miR-186 can reverse effect of SNHG3 on viability and SOD and LDH of H2O2 treated Eahy926 cells（±s，n=9）

表5 过表达miR-186可逆转SNHG3对H2O2处理的Eahy926细胞活性及SOD、LDH的影响（±s，n=9）Tab.5 Overexpression of miR-186 can reverse effect of SNHG3 on viability and SOD and LDH of H2O2 treated Eahy926 cells（±s，n=9）

Note：Compared with H2O2+pcDNA3.1-SNHG3+miR-NC group，1）P<0.05.

LDH/（U·L−1）681.70±71.55 1 317.26±124.291）13.295<0.001 Groups H2O2+pcDNA3.1-SNHG3+miR-NC H2O2+pcDNA3.1-SNHG3+miR-186 t P miR-186 0.97±0.10 0.37±0.041）16.713<0.001 CyclinD1 0.48±0.05 0.22±0.021）14.484<0.001 P21 0.31±0.03 0.64±0.061）14.758<0.001 Survival rate（%）87.95±7.12 44.67±4.391）15.523<0.001 SOD/（U·mg−1·prot−1）27.96±2.73 17.18±1.691）10.072<0.001

2.6 过表达miR-186 可逆转SNHG3 对H2O2处理的Eahy926 细胞凋亡的影响 与H2O2+pcDNA3.1-SN‐HG3+miR-NC 组相比，H2O2+pcDNA3.1-SNHG3+miR-186组Eahy926细胞Bax表达显著升高，Bcl-2表达显著降低，细胞凋亡率显著升高（P<0.05，图5、表6）。

图5 过表达miR-186 可逆转SNHG3 对H2O2处理的Eahy-926细胞凋亡的影响Fig.5 Overexpression of miR-186 can reverse effect of SNHG3 on apoptosis of Eahy926 cells treated with H2O2

表6 过表达miR-186 能逆转SNHG3 对H2O2 处理的细胞Eahy926凋亡的影响（±s，n=9）Tab.6 Overexpression of miR-186 can reverse effect of SNHG3 on apoptosis of Eahy926 cells treated with H2O2（±s，n=9）

表6 过表达miR-186 能逆转SNHG3 对H2O2 处理的细胞Eahy926凋亡的影响（±s，n=9）Tab.6 Overexpression of miR-186 can reverse effect of SNHG3 on apoptosis of Eahy926 cells treated with H2O2（±s，n=9）

Note：Compared with H2O2+pcDNA3.1-SNHG3+miR-NC group，1）P<0.05.

Groups H2O2+pcDNA3.1-SNHG3+miR-NC H2O2+pcDNA3.1-SNHG3+miR-186 Bax 0.23±0.02 Bcl-2 0.66±0.07 Apoptosis rate（%）13.89±1.35 0.59±0.061）0.31±0.031）24.14±2.231）11.796<0.001 t P 17.076<0.001 13.787<0.001

3 讨论

血管内皮细胞损伤是引起一系列心血管疾病的重要原因，对人类身体健康危害极大［10］。细胞凋亡是导致血管内皮细胞损伤的主要原因，氧化应激也与血管内皮细胞损伤有关［11］。SOD 是清除自由基的抗氧化酶，其活性高低反映机体抗氧化能力大小；LDH 是一种糖酵解酶，其漏出量反映细胞膜受损程度［12］。本研究采用H2O2处理Eahy926 细胞，结果显示，细胞存活率显著降低，细胞凋亡率显著升高，SOD 活性显著降低，LDH 水平显著升高，说明血管内皮细胞损伤模型建立成功。

研究报道，SNHG3 上调通过沉默Kruppel 样转录因子2（kruppel-like factor 2，KLF2）和P21 促进胶质瘤细胞增殖，并抑制细胞凋亡，促进神经胶质瘤恶性进展［13］。SNHG3 通过miR-182-5p 促进结直肠癌恶性发展［14］。SNHG3 过表达可防止体内缺氧/缺血性脑损伤和体外海马细胞损伤［15］。lncRNA SNHG3通过充当miR-485 的ceRNA 上调ATG7 表达，从而促进自噬诱导的神经元细胞凋亡［16］。提示SNHG3不仅参与调控重力进展，还影响细胞缺氧损伤。本研究显示，过氧化氢处理的Eahy926 细胞SNHG3 表达显著降低，过表达SNHG3 后，细胞存活率显著升高，凋亡率显著降低，SOD 活性显著升高，LDH 水平显著降低，CyclinD1、Bax 表达降低，P21、Bcl-2 表达升高，表明过表达SNHG3 可促进Eahy926 细胞存活，抑制过氧化氢处理的Eahy926细胞凋亡，抑制氧化应激。提示过表达SNHG3 可保护过氧化氢诱导的血管内皮细胞损伤。

研究发现，缺氧状态下血管内皮细胞miR-186表达明显升高，干扰其表达可对细胞损伤起一定保护作用［9］。miR-186-5p 通过靶向Toll 样受体3（Tolllike receptor 3，TLR3）调节高糖诱导的心肌细胞凋亡［17］。hsa_circ_0010729 通过靶向miR-186/HIF-1α调节血管内皮细胞增殖和凋亡［18］。lncRNA SNHG16通过调节miR-186 表达促进肝癌增殖、迁移和侵袭［19］。表明miR-186参与调控血管内皮细胞凋亡及损伤等过程，且miR-186 可受lncRNA 和circRNA 调控。为研究lncRNA SNHG3 是否与miR-186 具有调控关系，本研究通过在线软件预测显示，lncRNA SNHG3 与miR-186 存在结合位点，且通过双荧光素酶报告实验证实SNHG3 靶向调控miR-186 表达，同时过表达miR-186和lncRNA SNHG3，H2O2处理的细胞存活率显著降低，细胞凋亡率升高，SOD 活性显著降低，LDH 水平显著升高，表明过表达miR-186逆转了SNHG3 对H2O2处理的Eahy926 细胞活性、凋亡及SOD、LDH 的影响。提示SNHG3 可能通过调控miR-186保护过氧化氢诱导的Eahy926细胞损伤。

综上，过表达SNHG3 可能通过下调miR-186 表达保护过氧化氢诱导的Eahy926细胞损伤。