胃肝样腺癌中PD-L1 表达与临床病理特征的关系及对预后的影响*

王涛，王蒙，梁彦旭，杜书祥，周杨，吴刚，孙培春

450003 郑州，郑州大学人民医院/河南省人民医院 胃肠外科

胃肝样腺癌（hepatoid adenocarcinoma of the stomach，HAS）是胃癌中一种罕见的组织学类型，在所有胃癌中发生率≤1%［1］，由于目前对HAS 认识非常有限，临床上容易对其造成误诊和漏诊。HAS 由多角形嗜酸性肝细胞样肿瘤细胞组成，常伴有AFP不同程度的升高［2］。研究表明HAS 患者的预后较差，且易发生淋巴结转移和肝转移［3］，目前HAS 的治疗主要以手术和化疗为主，但治愈率极低。近年来，免疫检查点抑制剂已成为肿瘤免疫治疗的热点，其机制是通过阻断程序性死亡受体1（programmed death-1，PD-1） /程序性死亡配体1（programmed deathligand 1，PD-L1）信号通路来改善人体自身免疫系统，从而达到杀死肿瘤细胞的目的［4］。多项研究表明普通胃腺癌中PD-L1 的表达与淋巴结转移、远处转移、浸润深度、血管浸润和恶性程度显著相关［5-6］，且预示不良的预后。我们通过研究HAS 中PD-L1的表达情况，分析PD-L1 过表达是否可促进HAS 转移和浸润并影响预后。因此，探讨HAS 中PD-L1 表达与临床病理特征的关系及对预后的影响，深入了解HAS 的复发转移机制，可为PD-L1 阳性HAS 的免疫治疗提供新的依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料

收集2014 年1 月至2021 年5 月我院收治的42 例HAS 患者的临床病理资料，并由两名病理科医师对病理信息进行重新确认。男33 例，女9 例，年 龄40 ～ 81 岁，平均年龄62.17 岁；PD-L1 阳 性25 例；AFP 染色阳性30 例；Ki67 阳性33 例；肿瘤分期根据第8 版UICC/AJCC TNM 分期确定，其中Ⅰ～Ⅱ期9 例，Ⅲ～Ⅳ期33 例；根据肿瘤分化程度：低分化27 例，中 ～ 高分化15 例；肿瘤浸润深度：T1/T2 7 例，T3/T4 35 例；出现淋巴结转移28 例；肿瘤位于贲门11 例、胃体15 例、胃窦16 例；溃疡型30 例；肿瘤直径 ＞ 5 cm 21 例；存在脉管内癌栓29 例；神经侵犯24 例；19 例出现远处转移（16例肝转移、1 例肺转移、2 例同时出现胰腺、十二指肠和横结肠受侵）。

通过电话、短信及门诊随访，总生存期（overall survival，OS）从HAS 确诊开始计算到患者死亡或末次随访时间，42 例HAS 患者均有完整的随访资料。

1.2 检测方法与阳性判定

1.2.1 PD-L1 蛋白的检测 试剂采用兔抗人PD-L1单克隆抗体（克隆号22C3，丹麦DaKo 公司）。采用免疫组化MaxVision 法。将组织标本切片后固定-脱水-透明-浸蜡后，切成薄片（4 ～ 5μm）备用，采用樱花SAKURA Tissue-Tek 染色机进行HE 染色，使用全自动免疫组化机对组织标本进行免疫组化染色。按照22C3 PharmDx 试剂盒的操作流程进行操作，然后对切片进行复染-封片-阅片。PD-L1 蛋白检测均以人足月胎盘组织切片为阳性对照，以阴性质控抗体代替一抗作为阴性对照。我们采用联合阳性评分（combined positive score，CPS）来评估HAS组织中PD-L1 蛋白的表达水平，相较于肿瘤细胞阳性比例评分，CPS 不仅评判肿瘤细胞中PD-L1 的表达水平，同时也引入了淋巴细胞、肿瘤相关巨噬细胞等免疫细胞，可以筛查出更多可能从免疫治疗中获益的患者［7-8］。

1.2.2 PD-L1 阳性判定 PD-L1 阳性判定：CPS 计数标准 = （PD-L1 阳性的肿瘤细胞、淋巴细胞和巨噬细胞总数）/活的肿瘤细胞总数×100%。当 CPS ≥1%时，判定PD-L1 表达阳性［8］。

1.3 HAS 的病理组织学诊断

HAS 的诊断主要依靠病理组织学，病理形态上出现肝细胞分化区域的胃癌，不管血清AFP 或AFP染色是否阳性，均可诊断为HAS。在HE 染色下，肝样分化区类似于肝癌的病理学特征，由大、多角形嗜酸性肿瘤细胞构成，呈梁索状或实性巢状排列，胞质呈嗜伊红性细颗粒状红染、部分透明样，胞浆、血窦丰富［9］。HAS 镜下常表达Hep Par-1、Glypican-3、SALL4、AFP、CK19、CDX-2 等免疫组化标志物，可辅助诊断和排除诊断。HAS 的病理组织通常表现为普通腺癌与肝样分化区共存。一般将仅含肝样分化区的HAS，定义为单纯型胃肝样腺癌（simple hepatoid ad-enocarcinoma of stomach，SHAS）；将含有普通腺癌的HAS，定义为混合型胃肝样腺癌（mixed hepatoid adenocarcinoma of stomach，MHAS）［10］。

1.4 统计学方法

采用SPSS 20.0 统计软件分析，PD-L1 表达与临床病理特征的关系应用χ2检验、连续校正卡方检验和Fisher 精确检验，PD-L1 表达和各项临床病理特征与预后的关系采用单因素分析和多因素COX回归分析。生存数据采用Kaplan-Meier 法和Log-Rank 检验分析，并绘制生存曲线。P＜ 0.05 为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 HAS 癌组织、癌旁组织中PD-L1 的表达情况

HAS 组织PD-L1 阳性表达率明显高于癌旁组织（59.52%vs4.76%），且差异具有统计学意义（P＜ 0.01，表1）。

表1 PD-L1 在癌与癌旁组织中表达的差异Table 1．PD-L1 Expression in Cancer and Adjacent Tissues

2.2 MHAS 中肝样腺癌区与普通腺癌区的PD-L1表达差异

在42 例HAS 中，20 例为SHAS，22 例为MHAS。在22 例MHAS 中，肝样腺癌区与普通腺癌区同时表达PD-L1 占31.82%（7/22），肝样腺癌区PD-L1 阳性率为54.55%（12/22），而普通腺癌区中PD-L1 阳性率为40.91%（9/22），但两者的PD-L1 表达并无差异（χ2= 0.820，P= 0.365）。

2.3 HAS 中PD-L1 的表达与临床病理特征的关系

HAS 中PD-L1 过表达与淋巴结转移、脉管内癌栓显著相关（P＜ 0.05），而与患者年龄、性别、肿瘤直径、TNM 分期、分化程度、肿瘤浸润深度、肿瘤位置、神经侵犯和远处转移均无相关（P＞ 0.05，表2）。

表2 胃肝样腺癌中PD-L1 表达与临床病理特征的关系Table 2．Relationship between PD-L1 Expression in and Clinicopathological Features of Hepatoid Adenocarcinoma of the Stomach

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2.4 HAS 患者的预后情况

42 例患者随访截止时间2021 年10 月，随访5～56 个月，随访期间29 例患者死亡，平均生存期为26.9个月，中位生存期15 个月，1 年生存率为69.05%，3 年生存率为38.10%（图1）。根据Kaplan-Meier 生存曲线分析，PD-L1 过表达与HAS 患者OS 密切相关，即PD-L1 阳性者较阴性者术后生存时间明显缩短（χ2= 4.813，P= 0.028，图2）。

2.5 HAS 患者的生存分析

COX 单因素分析表明，年龄、远处转移、TNM 分期、淋巴结转移、脉管癌栓、AFP 染色、PD-L1 过表达是影响HAS 患者预后的不良因素（P＜ 0.05，表3）；COX 多因素回归分析表明，术前有无远处转移、TNM 分期、AFP 染色是HAS 患者生存的独立影响因素（表4）。

图1 HAS 患者生存曲线图Figure 1．Survival of HAS Patients

图2 PD-L1 阳性表达的HAS 患者生存曲线Figure 2．Survival of HAS Patients with Positive PD-L1 Expression

表3 胃肝样腺癌预后单因素分析Table 3．Univariate Analysis of the Prognosis of Hepatoid Adenocarcinoma of the Stomach

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表4 胃肝样腺癌预后多因素分析Table 4．Multivariate Analysis of the Prognosis of Hepatoid Adenocarcinoma of the Stomach

3 讨 论

HAS 是胃癌的特殊亚型，发病率极低，早期易转移，预后差［10-12］，既往研究表明HAS 中位生存期为6～17 个月［13］，1 年、3 年、5 年生存率分别为30%～60%［14］、13%～52%［14-15］、9%～20%［16］。本研究HAS 中位生存期为15 个月，1 年、3 年生存率分别为69.05%和38.10%。如何早期准确诊断HAS至关重要，目前HAS 诊断金标准为病理组织学检测，但也有许多免疫标志物可协助诊断，如SALL4在成人正常胃组织及胃癌组织中不表达，在普通型胃癌中部分表达，而在HAS 中呈弥漫性表达［10］。Hep Par-1 是一种针对正常肝细胞和肿瘤肝细胞的单克隆抗体，被认为是正常肝细胞和肿瘤肝细胞的特异性标志物。CDX-2 在肠道肿瘤和伴有肠型上皮分化的肿瘤均表达阳性。CK19 在胃腺癌、胆管细胞癌和结直肠癌中阳性表达，在肝癌中较少表达，如果CK19阴性则可排除HAS，而CK19阳性可除外肝癌，这在HAS 肝转移时具有重要的诊断意义［17］。在我们的研究中42 例HAS 患者免疫组化显示胎肠标志物如AFP 染色阳性率为71.43%（30/42）、Glypican-3阳性率为67.65%（23/34）、SALL4 阳性率为68.75%（22/32）、CDX-2 阳 性 率 为65.71%（23/35）、CK19 阳性率为100.0%（35/35），肝细胞标志物Hep Par-1 阳性率为76.47%（26/34），以上免疫标记物在HAS 中广泛表达是协助诊断HAS 的灵敏指标。

研究表明肿瘤标记物（AFP、CEA、CA199 等）对HAS 的诊断有一定的辅助价值，且与患者的预后相关。既往研究表明肿瘤标记物CEA 升高预示HAS患者预后较差［16］，但鲜有研究探讨其他肿瘤标记物对HAS 的预后价值。本研究结果显示AFP 阳性率为59.52%（25/42）；CEA 阳性率为45.24%（19/42）；CA199 阳 性 率 为50.00%（21/42），对AFP、CEA 和CA199 进行单因素分析发现三者对HAS 患者的预后均无影响（P＞ 0.05），由于本研究样本量较小，今后仍需大量研究探讨血清肿瘤标记物对HAS 患者的预后影响。我们还对可能影响HAS 患者预后的其他因素进行单因素分析发现，PD-L1 表达、年龄、淋巴结转移、TNM 分期、远处转移、AFP 染色、脉管癌栓是影响HAS 患者预后的不良因素（P＜ 0.05）。但进行多因素COX 回归分析发现PD-L1 表达、年龄、淋巴结转移、脉管癌栓并不是影响HAS 预后的独立影响因素，而AFP 染色、TNM 分期、远处转移为HAS 患者预后的独立影响因子（P＜ 0.05）。

PD-L1 是B7 共刺激分子家族的成员，与PD-1结合后，PD-1 胞质区的TISM 结构域中的酪氨酸发生磷酸化，募集SHP-2 磷酸酶，使Igα/β 和Syk发生去磷酸化，从而传递抑制性信号［18］，这种信号对免疫细胞产生抑制作用，从而导致肿瘤细胞发生免疫逃逸和增殖。目前少有研究报道PD-L1 在HAS 中表达与临床病理特征的关系及对预后的影响。我们试图对42 例HAS 患者癌组织进行免疫组化检测，观察PD-L1 在HAS 中的表达水平，结果表明HAS 组织中PD-L1 的表达明显高于癌旁组织，且阳性率高达59.52%。而PD-L1 在普通胃腺癌和肝细胞癌中表达情况又如何呢？Wu 等［19］的研究表明340 例普通胃腺癌中PD-L1 的阳性率为40.3%，而李毓飞等［20］的研究表明胃癌中PD-L1的阳性率为37.3%，均低于HAS 中PD-L1 的表达水平；在肝细胞癌的有关研究中，PD-L1 阳性率在17% ～ 92.3%之间，差异较大，可能与样本量、染色技术、判定标准不同有关［21-23］。我们还对MHAS中肝样腺癌区与普通腺癌区的PD-L1 表达进行分析发现，MHAS 中肝样腺癌区与普通腺癌区共表达PD-L1 占31.82%，尽管肝样腺癌区PD-L1 的阳性表达率（54.55%）明显高于普通腺癌区（40.91%），但两者PD-L1 表达并无差异（P＞ 0.05）。进一步研究发现，HAS 中PD-L1 的阳性表达与淋巴结转移、脉管癌栓显著相关（P＜ 0.05）。王闫飞等［14］对30 例HAS 患者的病理资料进行分析，其中16例检测了PD-L1 的表达情况，发现PD-L1 的表达对HAS 患者的预后并无影响，我们对PD-L1 阳性 HAS 患者进行Kaplan-Meier 生存分析，发现PD-L1 过表达与HAS 患者生存期密切相关，PD-L1阳性者较阴性者生存期明显缩短（P＜ 0.05），这也证实PD-L1 在HAS 的进展中起着重要作用。PD-L1 阳性HAS 可能具有多种诱导PD-L1 表达的机制，并提示PD-1 驱动的免疫逃避可能在PD-L1阳性 HAS 中发挥重要作用，今后仍需大量研究进一步探讨。目前，HAS 治疗仍以手术与化疗为主的综合治疗模式，但HAS 的OS 却没有得到明显的改善。近年来，免疫检查点抑制剂在多种恶性肿瘤的治疗中取得良好效果［24］。2022 中国临床肿瘤学会胃癌诊疗指南中，我国已经将免疫治疗地位提升至一线并覆盖晚期胃癌全程治疗中，因PD-L1阳性HAS 患者的肿瘤微环境中也存在免疫抑制，故HAS 患者可能也是PD-L1/PD-1 抑制剂治疗的受益人群。早期检测HAS 中PD-L1 的表达情况对HAS 的治疗有一定指导意义，早期使用PD-1/PD-L1 抑制剂治疗PD-L1 阳性 HAS 患者可能会展现出更好的效果。

本研究尚存在一定的局限性。首先，由于部分病例存在随访时间的不足，故仅报道了3 年生存率的结果。其次由于本研究为回顾性研究，时间跨度长，有些临床病理数据缺失，可能对结果造成影响。最后本研究纳入的病例数较少，今后还需大量研究进一步探讨和验证结果。

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