桑黄有效物的提取应用及抑菌性能研究＊

谢晓韦，孙雨晴，陆龙喜，霍进喜，潘新平，胡桂燕＊

（1.浙江省检验检疫科学技术研究院，浙江 杭州 311215； 2.浙江省农业科学院，浙江 杭州 310021；3.浙江省疾病预防控制中心，浙江 杭州 310051； 4.浙江菊丝明生物科技有限公司，浙江 嘉兴 314500）

桑黄（Phellinus linteus.）是一种寄生在阔叶树上非常珍贵的药用真菌，有很高的药用价值，作为中药的应用历史悠久，在《神农百草经》和《本草纲目》中均有记载。中医中主要用来治疗妇科炎症和脾虚泄泻，现代药理学研究表明桑黄具有调节免疫抗炎，抗癌等功效[1]；桑黄提取物具有多种生物有效活性成分，如桑黄多酚、多糖、黄酮等，在抗氧化、抗炎症、抗肿瘤、抗衰老、提高免疫力等生物功效[2-4]。痤疮、湿疹等常见的有损美观的皮肤症状，青少年痤疮发病度接近60%，它是由遗传、内分泌、过敏原、微生物等多方面因素引发，其中细菌、真菌等致病菌在上述问题皮肤中检出率很高。林麟等对149例湿疹患者进行研究，发现121例携带细菌，其中金黄色葡萄球菌是最为常见的细菌（42.96%）[5]。昝文华等研究发现，痤疮病损中葡萄球菌的检出率与痤疮丙酸杆菌接近，且应用葡萄球菌菌苗治疗痤疮收到了良好的效果[6]。高峰等调查发现，在痤疮患者中马拉色菌的带菌率高达83.57%[7]。以上提示表明，痤疮、湿疹等常见皮肤病症与某些细菌感染有关。

本项目结合上述两大因素，通过优选提取方法提取人工培养桑黄子实体中桑黄多酚为主的有效活性成分，开展桑黄有效物（多酚-桑黄醇溶组分中的主要成分）的抑菌作用及机理研究，并应用在抑菌抗菌产品和化妆品中，研发了“菊丝明皮肤抑菌霜”和“桑黄祛痘护肤膜”，并分别进行动物抑菌试验和人体皮肤疗效观察试验，观察产品的抑菌性能和问题皮肤的治疗效果，为桑黄有效物的开发应用提供更广宽的途径。

1 材料与方法

1.1 试验材料与仪器

1.1.1 试验材料

桑黄由浙江省农科院蚕桑与茶叶研究所提供，桑黄有效物由本学科的实验室提取；蚕茧由浙江省农科院蚕茶研究所提供，丝胶蛋白液由本学科的实验室水解；聚乙烯醇、卡波尔、丙三醇、脂肪醇、脂肪酸酯、乙醇、正丁醇、乙酸乙酯、菌种、净化水等辅料，由杭州仁裕贸易有限公司和杭州高琦化妆品有限公司提供。

1.1.2 仪器

主要实验仪器：臭氧发生器，广州佳环电器科学有限公司；超声波提取罐，昆山市超声仪器有限公司；旋转蒸发器，上海申胜生物技术有限公司；超净工作台，苏州净化设备有限公司；灌装设备，无锡市灵美日用化工机械厂；辅助设备：目筛、紫外线消毒灯、电子天平、水浴锅、烘箱、培养箱等。

1.2 试验方法

1.2.1 产品制备工艺流程

利用浙江省农业科学院自主培育的桑黄子实体，经粉碎，浸提，超声波处理，过滤，浓缩后，得到精制桑黄多酚有效物；丝胶茧经脱胶、生物降解，过滤，浓缩，得到精制的丝胶蛋白液；净化水和辅料加热溶解，然后加入桑黄多酚有效物和丝胶蛋白液，分别经均质乳化和混合搅拌，冷却静止，得到桑黄抑菌霜和桑黄丝胶蛋白祛痘膜产品。其工艺流程如图1所示。

图1 提取和应用试验工艺流程Figure 1 Extraction and Application Test Process Flow

1.2.2 桑黄多酚的提取纯化

将干燥桑黄子实体粉碎过80目筛，取样本4份，分别用水、75%乙醇、正丁醇、乙酸乙酯按1 g∶10 mL浸提，并在60℃水浴中超声波（100 Hz）处理5 h，然后将不同溶剂处理获得的提取液旋转蒸发，去除溶剂成份，至小体积获得提取液，65℃烘箱中烘干，获得桑黄多酚粗提物。桑黄多酚的纯化方法如下：称取100 g活化的D101大孔树脂加入锥形瓶中，加入无水乙醇浸过树脂，完全吸收后补充去离子水，静置15 min后倾倒醇水溶液，继续加入去离子水后倾倒醇水溶液，此反复洗涤至无醇味，用滤纸吸干树脂表面的水分。向锥形瓶内加入2 g/L的多酚提取物溶液，密封置于摇床内室温下120 r/min振荡24 h。倾出上清，树脂用超纯水冲洗5遍，然后用95%乙醇洗脱树脂，直至洗脱液颜色较为澄清。合并洗脱液，用旋蒸仪浓缩至小体积后置于65℃烘箱中烘干，获得纯化后的桑黄多酚。

1.2.3 总酚含量测定

准确称量提取物100 mg，加入2 mL相应提取试剂充分溶解，用水稀释至10 mL后，取溶液2 mL，置25 mL棕色量瓶中，加入福林酚试剂1 mL，加水10 mL，用29%碳酸钠溶液稀释至刻度，摇匀，放置30 min，离心，取上清液，以相应的试剂为空白，在760 nm的波长处测定吸光度。以没食子酸为标准品，绘制标准曲线。样品中的多酚含量用没食子酸当量表示。

2 试验结果

2.1 桑黄不同溶剂提取物的得率及多酚含量

由表1可知：采用水、75%乙醇为溶剂浸提，粗提物得率和多酚得率均较高；综合提取成本、操作方便程度、环保等因素，以水、75%乙醇为溶剂浸提容易规模化、产业化生产。

表1 不同溶剂对桑黄多酚的提取效果Table1 Polyphenol Content of Different Solvent Extracts

2.2 桑黄乙醇提取物的抑菌作用

桑黄乙醇提取物对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌具有明显的抑制作用，在0.02 g/mL质量浓度下对金黄色葡萄球菌的抑制率达到93.6%，对大肠杆菌的抑制率为89.9%；在0.0667 g/mL质量浓度下对金黄色葡萄球菌的抑制率可达100%。

2.3 “菊丝明皮肤抑菌霜”的抑菌作用

依据GB15979—2002《一次性使用卫生用品卫生标准》的要求，产品抑菌率≥50%才符合标准。选用试验菌株为大肠杆菌ATCC 25922、金黄色葡萄球菌ATCC 6538、白色念珠菌ATCC 10231，中和剂为D/E中和肉汤，消毒液为原液。在检测样品“菊丝明皮肤抑菌霜”原液和对照样品无菌水上滴加菌悬液0.1 mL，混匀作用至预定时间，适当稀释，做活菌菌落计数。菊丝明皮肤抑菌霜样品对试验菌株的抑菌效果见表2所示。采用添加了桑黄提取物的菊丝明™皮肤抑菌霜样品原液，经检测，在作用时间为2 min、5 min、10 min、20 min时，对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、白色念珠菌抑菌率均大于99.9%，该样品对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、白色念珠菌均有较强抑菌作用。

表2 菊丝明皮肤抑菌霜的抑菌作用Table 2 Antibacterial Effect of Jusiming Skin Antibacterial Cream

2.4 桑黄丝胶蛋白祛痘护肤膜人体功效评价

2021～2022年期间，本课题组人员将实验室研制的桑黄丝胶蛋白祛痘护肤膜100余盒，免费提供给我院内外的粉刺、痤疮患者试用，目前收回试用报告30余份，其中女性21名，男性9名，年龄最小的16岁，最大的83岁，粉刺、痤疮患者在16～30岁之间，病期3年以上；色素沉着、黄褐斑、手足皲裂患者在30岁以上，病期大于10年。使用方法：洗脸后将桑黄丝胶蛋白祛痘护肤膜轻轻涂在面部和皮肤皲裂处，约30 min左右待膏体成膜后，用手揭去膜层；粉刺、痤疮患者2 d～3 d使用一次，色素沉着、黄褐斑、手足皲裂患者每日使用一次；每周观察一次，持续观察一个月。疗效判断标准：显效，症状明显消退，自我感觉症状显著减轻；有效，症状不同程度消退，自我感觉症状减轻；无效：症状无改善。经初步观察，试用效果总结如表3所示。桑黄丝胶蛋白祛痘护肤膜对粉刺、痤疮色素沉着、黄褐斑、手足皲裂均有一定的效果。

表3 桑黄丝胶蛋白祛痘护肤膜人体疗效观察结果Table3 Human Skin Efficacy Observation Results of Phellinus Anti-acne Skin Care Mask

3 结论

综合提取成本、操作便易程度、环境保护、提取物安全性能等因素，我们最后选择75%乙醇为溶剂浸提，这套工艺方法容易规模化、产业化生产。试验结果表明桑黄乙醇提取物对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌具有明显的抑制作用。研制成功的抗（抑）菌产品菊丝明®皮肤抑菌霜具有抑菌性能，对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、白色念珠菌均有较强抑菌作用。痤疮、粉刺是年轻人面部常见的皮肤疾病，因青春期人体内雄性激素水平较高，从而引起皮肤皮脂分泌过多，毛孔中堵塞，排泄不畅，导致细菌感染，发生皮肤炎症。桑黄有效物多酚等成份，具有消炎、抗炎、活血、生肌的作用。本研究经人体功效评价结果表明，桑黄丝胶蛋白祛痘护肤膜对粉刺、痤疮色素沉着、黄褐斑、手足皲裂有一定的效果。外用桑黄丝胶蛋白祛痘护肤膜后，液体面膜使用后渗透入毛孔内，留在表面的部份在30分钟内慢慢干燥，让皮肤表面形成局部“封包”状态，促进面膜中的桑黄等有效成人的吸收；液体面膜干燥后，洗除或撕掉时，同时去除了皮肤表面和毛孔中的不洁物质，保持毛孔畅通，最终使痤疮、粉刺慢慢治愈。因此，结合桑黄的实际特性，笔者认为桑黄乙醇提取物在抑菌产品和护肤品中添加应用存在较大的可能性，可以进一步研究，以扩大桑黄的应用范围，延伸桑黄多元化利用产业链，创造更多更大的社会经济效益。