南极磷虾原肌球蛋白纯化鉴定、理化特性及模拟表位肽预测

王 珊，刘 瑶，刘柯欣，张书琪，林松毅,2,3，孙 娜,2,3,*

（1.大连工业大学食品学院，辽宁 大连 116034；2.国家海洋食品工程技术研究中心，辽宁 大连 116034；3.海洋食品精深加工关键技术省部共建协同创新中心，辽宁 大连 116034）

原肌球蛋白（tropomyosin，TM）存在于除植物以外的所有真核细胞中[1]，被证明是一种交叉反应过敏原[2]，在无脊椎动物家族中被认为是泛变应原[3]，在虾等多个物种中被确定为主要过敏原[1]。它是一种高度保守蛋白，平均长度约为284 个氨基酸残基，由两个平行的α-螺旋组成，分子质量约34～38 kDa[1]。TM是引起食物性过敏反应的第三大常见原因[4]。据报道，80%以上的虾类过敏反应均由TM引起[5]，且小剂量TM就足以引发严重的全身性临床过敏症状[6]。然而，引起过敏症状发生的并非整个蛋白质分子，而是其包含的一些抗原表位[7]。现阶段已有两种虾类的TM过敏原表位被识别并证实为特异性IgE结合区域[8]，公布于过敏蛋白结构数据库中[9]。南极磷虾是一种生物资源量巨大且绿色、天然的优质蛋白来源[10]。但目前我国对于南极磷虾蛋白的相关研究刚刚起步，对其开发利用尚不充分[11]。Motoyama等[12]通过血清学相关实验证实了南极磷虾TM是其主要致敏原，不过目前进一步对其特异性IgE结合表位的识别及结合能力的相关研究还近乎空白。因此，有关南极磷虾TM过敏原表位的深度挖掘对于其致敏性相关研究尤为重要。

表位也被称为过敏决定簇，是过敏原表面的特殊化学基团，可与抗体或抗原受体发生特异性结合[13]。表位通常由8～26 个氨基酸组成[13]，分为线性表位和构象表位两种。目前对于TM的致敏表位研究主要集中在线性表位上[14]。近年来，生物信息学技术不断发展进步，凭借其方便快捷、准确性高、成本低等诸多优点已逐步成为评估预测过敏原表位的有效手段[15]。Zheng Lina等[7]利用生物信息学技术成功预测出斑节对虾TM的8 条线性过敏原表位。Fu Linglin等[16]也通过生物信息学工具预测识别了中国对虾TM的12 条潜在过敏原表位。

本研究以南极磷虾（Euphausia superba）为主要研究对象，通过除肌浆蛋白、丙酮除脂、蛋白粗提、热处理除杂、等电点沉淀、硫酸铵盐析等多个步骤对其进行提取纯化；利用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulphate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）和超高效液相色谱-串联质谱联用（ultra-high performance liquid chromatographytandem mass spectrometry，UPLC-MS/MS）技术对目的蛋白进行相关鉴定；对南极磷虾TM进行热稳定性实验、pH值稳定性实验和体外模拟胃肠消化实验；根据欧洲分子生物学实验室-欧洲生物信息研究所（European Molecular Biology Laboratory-European Bioinformatics Institute，EMBL-EBI）分析比对不同甲壳动物TM的氨基酸序列同源性；同时结合5种常用的生物信息学分析工具对南极磷虾TM模拟表位肽进行预测，并利用SWISS-MODEL服务器对其空间结构进行同源建模；最终通过PyMOL软件将预测出的候选表位在其空间结构上进行一一映射。本研究旨在通过借助先进的生物信息学技术对南极磷虾TM模拟表位肽进行精准预测识别，并对其空间结构同源建模，为深入了解南极磷虾TM过敏原，进而对其开展后续的致敏性消减及相关低致敏性产品的开发提供一定参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

南极磷虾 大连辽渔远洋食品有限公司；二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）蛋白浓度测定试剂盒、SDS-PAGE试剂盒、α-糜蛋白酶（1∶1 200 U，来源于牛胰腺） 北京索莱宝科技有限公司；胃蛋白酶（1∶4 180 U，来源于猪胃黏膜） 美国Sigma公司；胰蛋白酶（1∶2 500 U，来源于猪胰腺） 生工生物工程（上海）股份有限公司；其他常规化学试剂和药品均购自天津大茂化学试剂厂。

1.2 仪器与设备

EASY-nLC 1000 UPLC系统、Q Exactive Plus MS仪美国赛默飞世尔科技公司；CR22N高速冷冻离心机、F-2700荧光分光光度计 日本Hitachi公司；PowerPac Basic垂直电泳仪 美国Bio-Rad公司；MF-ChemiBIS 2.0凝胶成像系统 以色列DNR公司；Infinite M200多功能酶标仪 瑞士Tecan公司；J-1500圆二色光谱仪 日本Jasco公司。

1.3 方法

1.3.1 南极磷虾TM提取纯化

参照Liang Yinlong等[17]方法并略有修改。所有提取纯化步骤若无特殊说明均在4 ℃下进行。取南极磷虾肉按1∶10（g/mL）加入预冷20 mmol/L磷酸缓冲液（pH 7.5），于组织捣碎机中捣碎。组织捣碎液于4 ℃、8 000 r/min离心10 min，取沉淀按1∶10（g/mL）重新加入磷酸缓冲液，重复操作3 次。将最后得到的沉淀物按1∶2（g/mL）溶于50%预冷丙酮中，用恒速电动搅拌器搅拌4 h，组织液于4 ℃、8 500 r/min离心15 min，沉淀重新按1∶2（g/mL）溶于丙酮溶液中，重复操作2 次。将离心得到的沉淀取出，于室温下自然风干24 h制成丙酮粉。取丙酮粉按1∶10（g/mL）加入20 mmol/L Tris-HCl缓冲液（pH 7.5，含1 mol/L KCl、10 mmol/Lβ-巯基乙醇），用恒速电动搅拌器搅拌抽提一夜，抽提液于4 ℃、10 000 r/min离心20 min，保留上清液。向上清液中加入1 mol/L HCl溶液调至pH 4.5，静置2 h后于4 ℃、8 500 r/min离心15 min，保留沉淀。将沉淀溶于适量20 mmol/L Tris-HCl（pH 7.5）缓冲液中，用1 mol/L NaOH溶液调至pH 7.6使沉淀完全复溶。向溶液中缓慢加入41%～60% (NH4)2SO4，边加边搅拌直至其完全溶解，静置4 h后于4 ℃、8 500 r/min离心15 min，保留沉淀。将沉淀重新复溶于适量20 mmol/L Tris-HCl（pH 7.5）缓冲液中，于100 ℃沸水浴10 min，待其冷却至室温后于10 000 r/min离心10 min，上清液于真空冷冻干燥机中冻干，置于－80 ℃保存备用。

1.3.2 蛋白质含量测定

参照BCA蛋白浓度测定试剂盒的使用说明书。依次向96 孔酶标板的蛋白标准品孔中加入20 μL质量浓度为0、0.05、0.1、0.15、0.2、0.3、0.4、0.5 mg/mL的BSA标准品溶液，再向96 孔酶标板的样品孔中依次加入20 μL被稀释至不同质量浓度的样品溶液（0.1、0.2、0.5、1、2 mg/mL），之后向各孔中加入200 μL BCA工作液。将酶标板于37 ℃避光静置15～30 min，利用酶标仪测定标准品溶液和样品在562 nm波长处的吸光度，绘制标准曲线，根据标准曲线计算提取纯化的南极磷虾TM样品中蛋白质含量。

1.3.3 SDS-PAGE实验

制备12%分离胶和4%浓缩胶。将提取纯化过程中各取样点及最终得到的南极磷虾TM样品均稀释至1 mg/mL，取适量样品与蛋白上样缓冲液（5×）按4∶1（V/V）混合均匀，于100 ℃沸水浴5 min。Marker上样5 μL，其余各样品均上样10 μL。浓缩胶中80 V电泳30 min，分离胶中100 V电泳180 min，结束后取出凝胶，用R-250染色2 h，加脱色液洗脱至各电泳条带清晰为止。最后利用凝胶成像系统扫描拍照。

1.3.4 目的蛋白UPLC-MS/MS鉴定

1.3.4.1 胶内酶解

将目的蛋白条带切取下来，用50%乙腈溶液（含50 mmol/L碳酸氢铵）脱色，加100%乙腈孵育5 min脱水。加入10 mmol/L二硫苏糖醇溶液于37 ℃孵育60 min，加100%乙腈脱水。之后加55 mmol/L碘代乙酰胺溶液于温室下避光孵育45 min后用50 mmol/L碳酸氢铵溶液清洗，再用100%乙腈脱水。最后加入含10 ng/μL胰蛋白酶的50 mmol/L碳酸氢铵溶液于冰上孵育1 h，弃去其余溶液，胶块于37 ℃下酶解过夜。依次用乙腈-甲酸（10∶1，V/V）溶液和100%乙腈提取酶解后的肽段，冷冻旋干备用。

1.3.4.2 UPLC-MS/MS分析

UPLC条件：ReproSil-Pur C18色谱柱（孔球形硅胶1.9 μm，孔径120 Å树脂填充）；流动相A：含0.1%甲酸和2%乙腈溶液；流动相B：含0.1%甲酸和90%乙腈溶液。梯度洗脱：0～22 min，94%～65% A、6%～35% B；22～26 min，65%～20% A、35%～80% B；26～30 min，20% A、80% B。流速550 nL/min。

MS条件：纳喷电离源；离子源电压2.1 kV；扫描范围m/z350～1 800；分辨率70 000；MS/MS条件：分辨率17 500；自动增益控制5×104；信号阈值5×103ions/s；最大注入时间200 ms；动态排除时间20.0 s。

1.3.4.3 数据库检索

用Proteome Discoverer 2.4软件对采集到的MS和MS/MS数据进行检索，数据库为Euphausia superba（UniProt，168 条肽段序列）。

1.3.5 南极磷虾TM性质测定

1.3.5.1 热稳定性测定

参照何欣蓉等[18]的方法并略有修改。称取适量提取纯化的南极磷虾TM冻干样品溶于去离子水中，稀释至1 mg/mL。吸取等量TM溶液于多个2 mL离心管中，分别将其置于20、30、40、50、60、70、80、90、100 ℃水浴加热30 min。待各离心管冷却至室温，于4 000 r/min离心5 min，取上清液进行后续分析。

1.3.5.2 pH值稳定性测定

参照何欣蓉等[18]的方法并略有修改。称取适量提取纯化的南极磷虾TM冻干样品溶于去离子水中，稀释至1 mg/mL。吸取等量TM溶液于多个2 mL离心管中，分别调节pH值至1.0、3.0、5.0、7.0、9.0、11.0、13.0，孵育1.5 h，而后将pH值调回7.0。吸取经酸碱处理后的各样品溶液进行后续分析。

1.3.5.3 体外模拟胃肠消化稳定性测定

参照Minekus等[19]的方法配制人工模拟胃液、肠液。参照Román-Carrasco等[20]的方法并适当修改进行体外模拟胃肠消化。模拟胃液消化反应体系共10 mL，胃蛋白酶活力与纯化的南极磷虾TM比例为182 U/mg，体系中TM终质量浓度为1 mg/mL。整个消化过程均在37 ℃水浴条件下匀速振荡进行。分别在消化第0、0.5、2、5、10、30、60、90、120分钟依次取样0.5 mL，同时立即加入0.1 mol/L NaOH终止液调节至pH 7.0终止消化。取模拟胃液消化终点溶液5 mL，加入配制好的人工模拟肠液至整个反应体系体积为10 mL，胰蛋白酶活力、糜蛋白酶活力与TM比例分别为34.5、0.44 U/mg，体系中TM终质量浓度为0.5 mg/mL。整个消化过程均在37 ℃水浴条件下匀速振荡进行。分别在消化第0、0.5、2、5、10、30、60、90、120分钟依次取样0.5 mL，随即沸水浴5 min终止消化。所有样品置于－20 ℃保存用于后续分析。

1.3.5.4 SDS-PAGE分析

对不同温度、pH值、消化时间处理下的样品稳定性进行SDS-PAGE分析，样品质量浓度均稀释至0.5 mg/mL，上样量10 μL，方法同1.3.3节。

1.3.5.5 荧光光谱分析

参考Li Ke等[21]的方法，稍作修改。通过荧光分光光度计测定不同温度、pH值、消化时间处理下样品的内源性荧光光谱。用缓冲液将各样品溶液稀释至0.05 mg/mL。设置激发波长为280 nm，发射光谱范围为250～500 nm，激发和发射狭缝宽度为10.0 nm，扫描速度为1 500 nm/min。

1.3.5.6 圆二色光谱分析

参考Lin Haixin等[22]的方法，稍作修改。应用圆二色光谱仪检测不同温度、pH值、消化时间处理下样品的二级结构稳定性。用缓冲液将各样品溶液稀释至0.005 mg/mL。设置扫描速度100 nm/min，带宽2 nm，响应时间1 s，在190～260 nm波长范围内测定样品的平均残留椭圆率及相对含量。

1.3.6 南极磷虾TM序列同源性分析

通过EMBL-EBI氨基酸序列数据库对南极磷虾TM与其他生物的TM序列同源性进行分析。将南极磷虾TM完整的氨基酸序列作为查询条件，利用EMBL-EBI数据库中Clustal Omega对比工具及UniProtKB/Swiss-Prot和UniProtKB/TrEMBL数据库进行同源序列检索[23-24]，最终得到TM氨基酸序列同源性相关信息。

1.3.7 南极磷虾TM模拟表位肽预测识别

1.3.7.1 南极磷虾TM氨基酸序列获取

通过美国国家生物技术信息中心（National Center of Biotechnology Information，NCBI）获取南极磷虾TM氨基酸序列信息。

1.3.7.2 生物信息学分析

利用生物信息学软件DNAStar Protean[25]、ANTHEPROT[26]对南极磷虾TM过敏原表位进行预测。通过对南极磷虾TM一级结构的亲水性、可塑性、抗原性、表面可及性和溶剂可及性等参数进行分析，预测识别出南极磷虾TM的线性模拟表位肽序列。

利用生物信息学在线工具BepiPred 1.0 server[27]、ABCpred server[25]和Immunomedicine Group[28]分别对南极磷虾TM过敏原表位进行预测：BepiPred 1.0 server通过结合隐马尔可夫模型和亲水性参数评分给出预测的线性表位序列[29]；ABCpred server基于人工神经网络模型分析预测其线性表位[25]；Immunomedicine Group根据抗原倾向预测识别出南极磷虾TM的模拟抗原决定簇。

对上述5种生物信息学工具分析预测出的南极磷虾TM的线性模拟表位肽序列进行整合，综合分析不同工具预测出的结果。

1.3.8 南极磷虾TM空间结构预测及模拟表位肽映射

利用SWISS-MODEL服务器[30]构建南极磷虾TM空间结构模型。登录SWISS-MODEL在线服务器，上传南极磷虾TM氨基酸序列，选择序列同源性最高的1c1g.2.A为模板自动建模，进而获得南极磷虾TM的空间结构模型。根据Structure Assessment模块中的拉氏构象图分析预测结果的稳定性。

利用PyMOL软件[31]对预测出的南极磷虾TM线性模拟表位肽在其空间结构中进行映射。将SWISS-MODEL服务器构建的南极磷虾TM空间结构模型以pdb格式导出，在PyMOL软件中打开该文件，以不同的标注颜色将各线性模拟表位肽一一映射到其空间结构对应的位置上。

1.4 数据处理

每组实验重复3 次，采用SPSS Statistics 19软件对实验结果进行差异显著性分析，通过TBtools软件绘制同源性分析结果，并用Origin 2019软件处理并绘制图表。

2 结果与分析

2.1 南极磷虾TM的提取纯化分析

如图1所示，南极磷虾肉经磷酸缓冲液去除肌浆蛋白、丙酮溶液除脂、抽提液粗提、热处理除杂、等电点沉淀、硫酸铵盐析等多步提取纯化操作，不断去除杂条带。根据泳道6目的蛋白条带与Marker条带的比对发现，最终仅在32 kDa附近得到单一条带。利用Image J软件对其进行灰度扫描分析，得到提取纯化的蛋白纯度达93.24%。研究表明，TM分子质量约34～38 kDa[1]，等电点约4.5[32]，是一种对热稳定的蛋白[33]。因此，经一系列提取纯化后最终在32 kDa附近得到的蛋白条带很可能是南极磷虾TM。

该提取纯化方法中最关键的几个步骤分别是热处理除杂、等电点沉淀和硫酸铵盐析。首先，由于TM是一种热稳定蛋白[33]，因此高温加热并不会使其发生降解，而其他不耐高温的蛋白则在此过程中被破坏，所以与泳道3相比泳道4的蛋白条带明显减少，部分条带也有减轻（图1）。其次，不同蛋白质的等电点各不相同，TM在其等电点处的溶解度最小[34]，因而在pH 4.5附近大部分的TM聚集析出。最后，大多数研究表明，硫酸铵饱和度在40%～90%时可将TM沉淀析出[35]，故在此基础上，本研究在41%～60%的硫酸铵饱和度下分离得到了大量盐析蛋白沉淀。经过以上几个重要的提取纯化步骤，最终得到了较为纯净的南极磷虾TM。该方法方便、快捷地得到了高纯度的南极磷虾TM，省去了液相、柱层析等繁琐的提取纯化步骤，同时也避免了蛋白的进一步损失，适合实验室采用。

图1 南极磷虾TM提取纯化SDS-PAGE图Fig. 1 SDS-PAGE patterns of crude and purified TM from Antarctic krill

2.2 目的蛋白UPLC-MS/MS分析

如图2所示，根据MS扫描结果初步确定目的蛋白的肽段数量及出峰位置，进而对所得肽段进行MS/MS扫描确定其氨基酸序列，共鉴定到89 条肽段，通过数据库检索发现该89 条肽段均属于UniProt数据库中收录的A7VKE0蛋白（E. superba，TM），将鉴定到肽段的氨基酸数目与该蛋白总氨基酸数目相比得到其肽段覆盖率达97%，从而确定提取纯化得到的目的蛋白为南极磷虾TM，登录号为A7VKE0，蛋白分子质量为32.6 kDa。

图2 南极磷虾TM的MS谱图Fig. 2 Primary mass spectrum of TM from Antarctic krill

2.3 南极磷虾TM性质分析

2.3.1 南极磷虾TM热稳定性分析

由图3a可知，温度由20 ℃逐渐升至100 ℃的过程中，TM条带保持稳定，均未发生降解，也无其他新的条带生成。荧光光谱技术用于检测蛋白内源荧光，通过分析光谱峰位、强度等变化进而推断蛋白质三级结构的变化[36]。由图3b可知，随温度的升高，南极磷虾TM在295 nm波长处的荧光强度逐渐增强。温度由20 ℃升至60 ℃的过程中，荧光强度变化幅度不大；值得注意的是当温度升至70 ℃时，荧光强度有较大程度提升；加热至80 ℃时，荧光强度明显增强，且直至上升至100 ℃时，荧光强度逐渐达到峰值，此间变化不再明显。这说明随着温度的升高，南极磷虾TM高级结构逐渐伸展，温度上升至70 ℃时，其内部疏水区域暴露可能增多，加热至80 ℃时，TM多肽链进一步伸展，使得疏水基团暴露程度大幅提高，荧光强度明显增强。圆二色光谱技术被广泛应用于分析蛋白质的二级结构组成和变化[37]。由图3c可知，南极磷虾TM在190 nm波长附近有一正谱带，在208 nm和222 nm波长附近有两个负谱带，且在温度为20 ℃时其椭圆度绝对值最大；随着加热温度的升高其椭圆度绝对值逐渐减弱，说明α-螺旋相对含量逐渐降低；然而，加热温度超过80 ℃的TM冷却至室温后其椭圆度绝对值又有一定幅度的增强。由图3d可知，南极磷虾TM主要由α-螺旋和少量无规卷曲结构组成；加热温度由20 ℃逐渐升至60 ℃时，α-螺旋相对含量逐渐降低，无规卷曲含量总体呈升高趋势，但变化幅度较缓；当温度升至70 ℃时，α-螺旋相对含量明显下降至最低，此时β-折叠相对含量明显增加；加热至80 ℃时，其结构组成与70 ℃时变化不大，无规卷曲相对含量最多，说明此温度下TM二级结构较为松散；值得注意的是加热温度自80 ℃后，α-螺旋相对含量略有回升，说明经高温加热冷却后，TM的α-螺旋结构有一定恢复。

图3 热稳定性测定中南极磷虾TM的SDS-PAGE图（a）、荧光光谱图（b）、圆二色光谱图（c）、二级结构相对含量（d）Fig. 3 SDS-PAGE patterns (a), fluorescence spectra (b), circular dichroism spectra (c), and relative contents of secondary structures (d)showing thermal stability of TM in Antarctic krill

2.3.2 南极磷虾TM的pH值稳定性分析

由图4a可知，pH值由1.0逐渐升至13.0的过程中，TM条带始终稳定存在，在其下方均没有生成其他小分子降解条带。由图4b可知，pH 5.0时，TM的荧光强度最强；pH值升至7.0时，荧光强度略有下降；随着pH值向更酸/碱的方向变化，荧光强度逐渐降低，且碱性条件下荧光强度较酸性条件下更低。这些说明南极磷虾TM在pH值接近其等电点（pH 4.5）时结构较稳定，经酸/碱处理后可能导致发色基团暴露的微环境发生变化，TM结构可能发生部分聚集或折叠，使部分氨基酸残基被包埋，且pH值偏离等电点程度越大其结构变化越严重，因此导致荧光强度的改变。由图4c可知，pH 5.0时，TM在208 nm和222 nm波长处的椭圆度绝对值最大；经酸/碱处理后，椭圆度绝对值逐渐减弱，说明α-螺旋逐渐减少，蛋白构象发生改变。由图4d可知，pH 5.0时，南极磷虾TM的α-螺旋相对含量最高，且结构仅由α-螺旋和少量无规卷曲组成；当pH值向酸/碱方向变化时，α-螺旋相对含量逐渐降低，β-折叠和无规卷曲逐渐增多；pH 13.0时，还出现了少量β-转角结构。这些说明经酸/碱处理后，TM构象发生改变，进而可能引起分子间静电作用力降低或削弱氢键结合；极端碱性条件下，TM变性程度较严重，但从整体上看南极磷虾TM依然保持以α-螺旋为主的二级结构。

图4 pH值稳定性测定中南极磷虾TM的SDS-PAGE图（a）、荧光光谱图（b）、圆二色光谱图（c）、二级结构相对含量（d）Fig. 4 SDS-PAGE patterns (a), fluorescence spectra (b), circular dichroism spectra (c), and relative contents of secondary structures (d)showing pH stability of TM in Antarctic krill

2.3.3 南极磷虾TM的体外模拟胃肠消化稳定性分析

图5 模拟胃液消化稳定性测定中南极磷虾TM的SDS-PAGE图（a）、荧光光谱图（b）、圆二色光谱图（c）、二级结构相对含量（d）Fig. 5 SDS-PAGE patterns (a), fluorescence spectra (b), circular dichroism spectra (c), and relative contents of secondary structures (d)showing simulated gastric digestion stability of TM in Antarctic krill

由图5a可知，南极磷虾TM在模拟胃液消化2 min开始出现降解，消化5 min时，出现较明显的降解条带；随着消化反应的进行TM条带逐渐变浅下移，随之产生一系列小分子降解条带，多集中于17～20 kDa之间；消化至120 min时，TM条带仍未完全降解。由图5b可知，随着模拟胃液消化反应的进行，TM在295 nm波长处的荧光强度在消化0.5 min时出现上升而后逐渐降低，在355 nm处产生一新峰，且荧光发射波长出现红移。说明在胃消化反应初期，TM构象可能发生伸展导致部分疏水区域暴露，随着消化时间的延长，其结构又重新且不断折叠变化，在此过程中可能有新的芳香族氨基酸侧链暴露出来。由图5c可知，TM在190 nm波长附近的峰的椭圆度逐渐降低，且在208 nm和222 nm波长处的峰的椭圆度绝对值逐渐减弱，说明α-螺旋不断减少。由图5d可知，随着模拟胃液消化，TM的α-螺旋相对含量整体呈下降趋势，β-折叠相对含量整体呈增加趋势，无规卷曲含量总体变化不大。这说明TM经胃液消化后蛋白结构发生部分折叠，但二级结构总体组成变化不明显。

由图6a可知，南极磷虾TM在随即进行的模拟胃-肠消化反应中被进一步降解，生成一系列分子质量更小的降解条带，主要集中在11～20 kDa之间；消化反应进行到60 min时，TM条带开始变得模糊；消化至120 min时，TM几乎被消化完全，条带基本消失。由图6b可知，在模拟胃-肠消化反应初期，TM在295 nm波长处的荧光强度迅速大幅降低，随后在295 nm和355 nm波长附近的荧光强度也不断下降，且在355 nm波长处出现轻微红移。表明TM在胰/糜蛋白酶作用下发生高度水解产生一系列小分子肽段，其结构迅速发生改变，而后这些水解肽段可能在分子相互作用下又重新形成聚集体掩埋了部分荧光发色基团，从而导致荧光猝灭；同时，构象改变又可能使部分新的芳香族氨基酸残基暴露引起红移。TM模拟胃-肠消化的圆二色光谱图显示出明显改变，如图6c所示：自消化0.5 min起，在208 nm和222 nm波长处的双负峰带消失，转为在200 nm波长附近的单负峰带，且谱线总体有蓝移的趋势。这说明经模拟胃-肠消化后，南极磷虾TM的α-螺旋结构完全消失、β型结构增加，且体系的亲水性降低、疏水性增高。由图6d可知，南极磷虾TM刚进入模拟胃-肠消化体系时，α-螺旋结构就被完全破坏并消失，无规卷曲和β-转角结构增多；β-折叠在整个消化过程中经历了减少-增加-减少等的动态变化，最终完全消失。这说明经过模拟胃-肠消化，南极磷虾TM的二级结构有序性降低，消化过程中结构发生动态变化，最终仅由大量无规卷曲和部分β-转角结构组成。

图6 模拟胃-肠消化稳定性测定中南极磷虾TM的SDS-PAGE图（a）、荧光光谱图（b）、圆二色光谱图（c）、二级结构相对含量（d）Fig. 6 SDS-PAGE patterns (a), fluorescence spectra (b), circular dichroism spectra (c), and relative contents of secondary structures (d) showing the simulated gastrointestinal digestion stability of TM in Antarctic krill

图7 TM氨基酸序列同源性分析Fig. 7 Homology analysis of amino acid sequence of TM

综上，南极磷虾TM在一定加热温度范围内具有较好的热稳定性，但在超过80 ℃的极端高温下，其疏水区域暴露，结构改变，α-螺旋结构易被破坏，然而冷却至室温后其天然构象又部分恢复重新形成；其次，南极磷虾TM对于pH值的变化较能维持稳定，且对酸性条件具有较强耐受性，而极端酸/碱条件可能使其部分变性，结构发生聚集或折叠；此外，南极磷虾TM对胃液消化具有较强的稳定性，能被胃蛋白酶初步降解产生一系列小分子肽段，其二级结构基本保持完整，而对进一步的肠液消化稳定性较差，最终被胰蛋白酶和糜蛋白酶完全降解，生成分子质量更小的肽段，结构变得松散无序。这些结果与何欣蓉等[18]对章鱼TM理化性质研究结论相似。这很可能与南极磷虾TM的结构及氨基酸组成有关；TM主要由α-螺旋结构组成[38]，α-螺旋结构具有一定的刚性，在蛋白质结构中发挥稳定性作用[39]，因此TM独特的α-螺旋结构极有可能是使其对热和酸碱保持极强耐受性的原因；此外，由于胃蛋白酶和胰蛋白酶、糜蛋白酶作用的氨基酸不同[40]，所以消化结果的差异很可能与南极磷虾TM的氨基酸序列组成有关。

2.4 南极磷虾TM氨基酸序列同源性分析

对于系统给出的45种不同生物TM氨基酸序列，亲缘关系越近的生物TM序列一致性越高。如图7所示，南极磷虾TM与太平洋磷虾TM的序列同源性高达98.2%，与斑节对虾、凡纳对虾等其他虾的TM序列同源性多数在88%以上，而与锯缘青蟹、腐食酪螨、水蚤等序列同源性稍低，分布在82%～88%之间。很多研究发现甲壳类动物TM具有高度保守的氨基酸序列，同源性在88%～100%，这种高度的序列同源性很可能正是甲壳类物种之间临床交叉反应发生频率高的原因[23]。此外，甲壳类动物TM与蟑螂、尘螨也有很高的序列同源性，分别为80%～97%和78%～98%[23]。这也与本研究分析结果几乎一致。

2.5 生物信息学预测南极磷虾TM模拟表位肽

从NCBI数据库中获得南极磷虾TM（GenBank：BAF76430.1）氨基酸序列，该蛋白共由284 个氨基酸组成。

二级结构、表面可及性、柔韧性、高亲水性、易暴露区域等均是预测抗原表位的重要特征，它们为表位鉴定提供了强有力的证据[7]。DNAStar Protean和ANTHEPROT软件主要以高亲水性、柔韧性、表面可及性和抗原指数4 个特征作为预测依据给出候选过敏原表位。BepiPred 1.0 server、ABCpred server和Immunomedicine Group通过氨基酸的理化性质，如二级结构、亲水性、可及性、柔韧性、暴露表面、抗原倾向等，分析预测出可能性高的过敏原表位。表1列出了各生物信息学工具预测出的过敏原表位区域。然而，每种软件单独使用时都会有一定的局限性[41]，因此，综合分析5种生物信息学工具的预测结果，同一表位被识别的软件越多，则其准确性可能越高，将不少于3种工具共同预测出的过敏原表位确定为南极磷虾TM候选模拟表位肽，如表2所示。共筛选得到8 条南极磷虾TM线性模拟表位肽序列，分别为EAQNKETNAKADKADDEVH、DLERSEERLN、TKLAEASQAADESER、EADRKYDE、ERAEERAEAG、VSEEKANQREEAYKEQI、RSVQKLQKEVDR、VNEKEKYKGI。

表1 各生物信息学工具预测的南极磷虾TM模拟表位肽Table 1 Mimotope peptides of TM in Antarctic krill predicted by immunoinformatics tools

表2 南极磷虾TM模拟表位肽最终预测结果Table 2 Definitive prediction results of mimotope peptides of TM in Antarctic krill

目前，一些甲壳类TM表位已被鉴定，如褐对虾（Penaeus aztecus）[8]、凡纳对虾（Litopenaeus vannamei）[42]、斑节对虾（Penaeus monodon）[7]、中国对虾（Penaeus chinensis）[16]等，具体表位信息如表3所示。对比发现，不同甲壳类TM间具有相似的表位序列，这很可能是它们彼此间具有高度过敏交叉反应性的原因之一。本研究预测得到的南极磷虾TM模拟表位肽与这些已经验证的甲壳类TM抗原表位相比显示出了较高的重叠率，对于其中部分表位序列具有高覆盖率，这说明本研究的预测结果可能具有较高的准确性；但对于模拟表位肽中某些氨基酸的组成及序列长度等方面与这些已被鉴定出的抗原表位仍具有一定差异。

此外，通过生物信息学工具预测出的表位仅仅是理论层面，还需要后续传统生物学方法结合免疫学实验等对其进行验证才能得到更加准确的过敏原表位。尽管如此，生物信息学技术还是凭借其快速、高效、精准等诸多优点为后续的蛋白致敏性相关研究提供了切实科学依据。

表3 不同甲壳类TM表位和南极磷虾TM模拟表位肽的比较Table 3 Comparison of mimotope of TM in different crustaceans and those in Antarctic krill

2.6 南极磷虾TM空间结构建模及模拟表位肽映射分析

如图8所示，通过SWISS-MODEL服务器对南极磷虾TM进行同源建模，采用序列近似度达55.99%的1c1g.2.A为模板，最终预测得到由两条肽链平行缠绕而成的α-螺旋构型的南极磷虾TM空间结构（图8a）。通过服务器自带的Structure Assessment模块对建模得到的TM空间结构稳定性进行评价，结果显示高达98.05%骨架的φ角和ψ角分布于可靠区，仅有0.53%分布于异常区（图8b）。因此，预测的南极磷虾TM空间结构模型是稳定可靠且具有高质量。

图8 南极磷虾TM空间结构预测Fig. 8 Spatial structure prediction of TM in Antarctic krill

南极磷虾TM模拟表位肽映射结果如图9所示。利用PyMOL软件将生物信息学工具最终预测出的南极磷虾TM的8 条模拟表位肽在其空间结构对应位置一一进行映射，可以看出候选模拟表位肽均匀分布在整个蛋白质中，且多位于α-螺旋内。

图9 南极磷虾TM模拟表位肽映射Fig. 9 Mapping of mimotope peptides of TM in Antarctic krill

3 结 论

通过对南极磷虾进行除肌浆蛋白、丙酮除脂、抽提液粗提、热处理除杂、等电点沉淀、硫酸铵盐析等多个步骤，最终提取纯化出较为纯净的目的蛋白，SDSPAGE显示其条带位于32 kDa附近，灰度扫描分析其纯度达93.24%。经UPLC-MS/MS鉴定该目的蛋白确为南极磷虾TM，蛋白分子质量为32.6 kDa，肽段覆盖率高达97%，UniProt蛋白数据库登录号为A7VKE0。通过对其进行进一步的性质研究得到南极磷虾TM是一种对酸碱具有较强耐受力和对热稳定的蛋白质，此外TM对胃液消化表现出较强稳定性，而对进一步的肠液消化稳定性较差，最终被降解为一系列小分子肽段。氨基酸序列同源性分析结果表明南极磷虾TM具有高度保守性，与26种甲壳类生物同源性在88%以上，与太平洋磷虾TM序列同源性更是高达98.2%。利用DNAStar Protean、ANTHEPROT、BepiPred 1.0 server、ABCPred server和Immunomedicine Group 5种生物信息学工具分别对南极磷虾TM模拟表位肽进行分析预测，最终共筛选出8 条致敏性极高的候选过敏原模拟表位肽，分别是EAQNKETNAKADKADDEVH、DLERSEERLN、TKLAEASQAADESER、EADRKYDE、ERAEERAEAG、VSEEKANQREEAYKEQI、RSVQKLQKEVDR、VNEKEKYKGI。同时利用SWISS-MODEL服务器对南极磷虾TM进行同源建模，预测得到其空间结构为α-双螺旋结构。通过PyMOL软件对预测到的8 条TM模拟表位肽进行一一映射，结果显示它们均匀分布在整个蛋白质结构中。本研究提取纯化得到了较为纯净的南极磷虾TM；同时利用多种生物信息学工具对其模拟表位肽的预测，不仅进一步增加了研究者对南极磷虾TM过敏原的认识，也极大程度上提高了结果的准确性；通过对其空间结构的预测及模拟表位肽的映射为过敏原表位的定位缩小了范围，使得定位更加精准。本研究为未来基于南极磷虾TM表位的相关研究提供了科学参考，不过对其准确的过敏原表位及其致敏性评价还需进一步实验验证。