基于自由基介导的酚酸-柑橘果胶接枝共聚物制备及其理化特性

杨鹄隽，左 锋,2,*，王 坤,3，许馨予，张慧敏,3，贾 斌,2

（1.黑龙江八一农垦大学食品学院，黑龙江 大庆 163319；2.粮食副产物加工与利用教育部工程研究中心，黑龙江 大庆 163319；3. 黑龙江八一农垦大学 国家杂粮工程技术研究中心，黑龙江 大庆 163319）

果胶是一种来源广泛、成本价低的天然植物多糖，其凝胶性、乳化性和乳化稳定性良好，已广泛应用于食品工业中，不仅可作为食品添加剂，还是益生元、膳食纤维及脂肪替代物等功能性食品的主要成分[1-2]。柑橘果胶是果胶应用中最为广泛的一种，主要从柑橘属的果皮中提取出来。柑橘果胶是FAO/WHO食品添加剂联合委员推荐的安全的天然食品添加剂，且不限定其每日允许摄入量[3]。然而，由于天然柑橘果胶分子质量较大、分子内和分子间氢键的相互作用，其溶解度较低，不易被人体吸收利用，导致生物利用率极低[4]。

通过修饰果胶分子链上的羟基，可得到具有独特理化性质和生物活性的果胶衍生物[5]。目前，果胶的改性方法包括pH值法、酶法、超声法、接枝法[6-9]等。其中，pH值法、酶法、超声法等存在操作复杂、成本昂贵以及对环境不友好等问题，导致其使用具有一定局限性。通过碳二亚胺化学交联法、酶催化接枝法、电化学法、超声辅助法和自由基介导法制备果胶接枝共聚物，因其操作简单、适用范围广、生物活性多样而被认为是改善果胶理化性质和功能性最有效的途径之一并且已逐渐成为国内外学者研究热点。Pasanphan等[10]通过1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐介导将没食子酸接枝到壳聚糖上，从而使壳聚糖的溶解性和抗氧化活性有所提高。Karaki等[11]通过合成的酶将阿魏酸氧化接枝于果胶上，引入阿魏酸实体增强其疏水性和抗氧化活性。Ryu等[12]利用电化学方法形成壳聚糖-邻二苯酚共聚物，从而提高壳聚糖的生物活性。因此，接枝改性可以改善多糖的结构、理化性质，并且根据接枝物的不同扩展其生物活性[10-12]。

酚类物质作为次生代谢产物，在自然界含量最为丰富，广泛存在于植物界中，如水果、蔬菜、谷类、橄榄和茶叶等[13]。酚类物质作为人类膳食的重要组成部分，具有多种生物活性，包括抗氧化、抗炎、抗癌和免疫调节活性等[14]。在近几年的研究中，自由基介导接枝法因具有经济、环保、安全以及可避免酚酸在反应过程中的降解和氧化等优点，已成功用于许多多糖-酚酸接枝共聚物的制备，如壳聚糖-咖啡酸、壳聚糖-阿魏酸、普鲁兰-阿魏酸[9,15-16]等。然而，基于自由基介导的接枝法对酚酸-柑橘果胶接枝共聚物的合成和结构研究甚少。

本研究以天然果胶为聚合骨架，采用自由基介导的接枝方法制备酚酸-柑橘果胶接枝共聚物；对改性前后的理化性质进行对比分析；利用傅里叶变换红外光谱和扫描电子显微镜对酚酸-柑橘果胶接枝共聚物的结构进行表征，以改善柑橘果胶溶解性，拓宽其在食品领域中的应用。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

柑橘果胶 河南佰卓果胶生物科技有限公司；福林-酚、碳酸钠、溴化钾、NaOH、香豆酸、VC、H2O2溶液、醋酸溶液、氮气、无水乙醇（均为分析纯） 上海麦克林生化科技有限公司。

1.2 仪器与设备

TE-124分析天平 赛多利斯科学仪器（北京）有限公司；TE-124 pH计 北京同德创业科技有限公司；Scientz-10N真空冷冻干燥机 宁波新芝生物科技股份有限公司；1200型高效液相色谱仪、Nexus 670型傅里叶变换红外光谱仪、S4800扫描电子显微镜、TG-DTA-LR型综合热分析仪 上海众路实业有限公司。

1.3 方法

1.3.1 改性柑橘果胶的制备

参考濮慧敏[15]的方法并略有修改。称取5.0 g果胶完全溶解于1%醋酸溶液中，加入0.150 mol/L VC溶液和1 g酚酸（没食子酸、香豆酸、香草酸、丁香酸、龙胆酸），搅拌均匀后调节溶液pH值至6.0。通氮气60 min，加入0.075 mol/L H2O2溶液启动反应。氮气下持续反应1 h，透析72 h，冷冻干燥。为去除未接枝的酚酸聚合物，将冻干后的反应产物用乙醇索氏抽提8 h，再用去离子水透析并冻干。

1.3.2 酚酸-柑橘果胶接枝共聚物的接枝度测定

根据福林-酚法[16]进行测定。取4 mL用蒸馏水配制的0.1 mg/mL样品溶液于试管中，加入1 mL 0.2 mol/L福林-酚试剂，混匀后，加入3 mL Na2CO3溶液，振动摇晃2 h。于4 000 r/min离心8 min，在760 nm波长处测定样品溶液的吸光度。将0.1 mg/mL的5种酚酸溶液稀释成不同质量浓度（0.01、0.02、0.03、0.04、0.05 mg/mL）的标准溶液，绘制标准曲线。根据标准曲线计算酚酸-柑橘果胶接枝共聚物中酚酸的质量浓度。按式（1）计算酚酸-柑橘果胶接枝共聚物的接枝度：

1.3.3 柑橘果胶分子质量的测定

使用凝胶渗透色谱（gel permeation chromatography，GPC）法[16]测定。准确称取2 mg样品，加水溶解，经过0.22 μm水相滤膜过滤后进行色谱分析。GPC条件：RI高效液相色谱检测器；流动相为0.1 mol/L NaNO2溶液；流速为1.0 mL/min；柱温为40 ℃。配制标准溶液：分别称取不同分子质量的多糖标准品各2 mg，根据其在GPC色谱图上的保留时间与其对应分子质量的对数（lgmw）作出相应的标准曲线。

1.3.4 柑橘果胶酯化度的测定

参考Wang Chun等[17]的方法。准确称取50 mg样品，在锥形瓶中用乙醇润湿，加入水使样品全部溶解，加入2 滴酚酞指示剂，使用0.02 mol/L NaOH标准溶液进行滴定，记录所消耗的NaOH标准溶液体积（V1）。加入20.00 mL 0.5 mol/L NaOH标准溶液，振荡混匀，加入等质量的HCl标准溶液，振荡摇匀。然后加入酚酞指示剂，再次用0.02 moL/L NaOH标准溶液滴定至变色，记录所消耗的NaOH标准溶液体积（V2）。按照式（2）计算柑橘果胶的酯化度：

1.3.5 柑橘果胶中半乳糖醛酸含量的测定

参照Kumar等[18]的方法绘制标准曲线：配制0.1 g/L半乳糖醛酸溶液，分别取0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL半乳糖醛酸溶液于25 mL离心管中，加入蒸馏水至1 mL。冰浴预冷，加入6 mL 18.4 mol/L浓硫酸，振荡摇匀后在冰水浴中冷却，再加热20 min，冷却至室温。分别加入0.2 mL 1.5 g/L咔唑-乙醇溶液，混匀后于暗处静置30 min，在526 nm波长处测定其吸光度。以蒸馏水作空白，半乳糖醛酸质量浓度为横坐标，吸光度为纵坐标绘制标准曲线，得到标准曲线回归方程。

柑橘果胶半乳糖醛酸含量测定：取0.1 g柑橘果胶样品溶于蒸馏水定容至100 mL。取1 mL样品溶液于25 mL离心管中，同上述操作，在526 nm波长处测定其吸光度。根据标准曲线计算柑橘果胶中半乳糖醛酸含量。

1.3.6 柑橘果胶溶解度的测定

参照Kumar等[18]的方法。取0.5 g样品，加入50 mL蒸馏水，室温下搅拌直至混匀。25 ℃、4 200 r/min离心25 min，取上清液至恒定质量的铝盒中，置于90 ℃的水浴锅中蒸干，再于105 ℃烘干箱中烘至质量恒定。按式（3）计算柑橘果胶的溶解度：

式中：m1为上清液烘干至质量恒定后与铝盒的总质量/mg；m2为铝盒质量/mg；m3为上清液质量/mg。

1.3.7 傅里叶变换红外光谱测定

采用压片法[17]进行测定。按质量比1∶100将样品与溴化钾混合进行压片，在4 000～500 cm-1波数范围内扫描。

1.3.8 柑橘果胶微观结构的观察

参照Kumar等[18]的方法。将样品粘在导电胶上，进行喷金处理。在放大50、1 000 倍、扫描电压10 kV条件下，用扫描电子显微镜观察其微观空间结构。

1.3.9 柑橘果胶的单糖组成测定

参照Khatkar等[19]的方法配制标准单糖混合溶液。样品与450 μL 0.3 mol/L NaOH溶液混合置于离心管中，加入50 μL 1.6 mmol/L乳糖和450 μL 0.5 mol/L 1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮溶液（甲醇作溶剂）混匀。于70 ℃水浴中反应30 min，用0.3 mol/L HCl溶液调节至pH 7。加入1 mL氯仿萃取，重复2 次，过0.45 μm水膜。

称取3 mg果胶样品于安培瓶中，加入1 mL 2 mol/L三氯乙酸，充氮气封管。置于110 ℃烘干箱中水解8 h，冷却至室温。氮气吹干三氯乙酸，用1 mol/L NaOH溶液调节pH 7，再用超纯水定容至1 mL。取400 μL样品进行衍生化。

高效液相色谱条件：Dionex CarboPac PA20离子色谱柱（150 mm×3.0 mm）；柱温30 ℃；进样量10 μL；流动相为0.1 mol/L NaOH溶液，流速0.5 mL/min；紫外检测波长为250 nm。通过标准曲线计算样品中单糖含量。

1.3.10 柑橘果胶的热重分析和差示扫描量热分析[16]

取10 mg剪碎的膜样品置于坩埚内，在4 mL/min的氮气流中，以空坩埚做对照，用综合热分析仪进行测试。热重分析参数：测试温度范围0～800 ℃，升温速率20 ℃/min。差示扫描量热分析参数：测试温度范围0～800 ℃，升温速率10 ℃/min；记录热重和差示扫描量热曲线。

1.4 数据处理

2 结果与分析

2.1 酚酸-柑橘果胶接枝共聚物的接枝度分析

表1 不同酚酸-柑橘果胶接枝共聚物的接枝度Table 1 Grafting degrees of different phenolic acid-citrus pectin copolymers

由表1可知，在自由基诱导的接枝反应中，柑橘果胶与5种酚酸均可发生接枝反应形成酚酸-柑橘果胶接枝共聚物，但其接枝度差异显著（P＜0.05）。这是由酚酸与柑橘果胶接枝部位的羟基含量不同，以及氧化还原体系对酚酸的降解程度不同所致[20]。5种酚酸中，丁香酸的羟基含量最高且丁香酸羟基受自由基作用脱氢氧根的程度最好[21]，所以丁香酸-柑橘果胶的接枝度最高，为（74.2±1.38）mg/g，其次是龙胆酸-柑橘果胶，其接枝度为（67.24±1.55）mg/g。因此，选择丁香酸-柑橘果胶和龙胆酸-柑橘果胶为后续实验样品。

2.2 酚酸-柑橘果胶接枝共聚物的分子质量分析

图1 原果胶及酚酸-柑橘果胶接枝共聚物的分子质量分布Fig. 1 Molecular mass distribution of pectin and phenolic acid-citrus pectin copolymers

由图1可知，接枝改性后，酚酸-柑橘果胶接枝共聚物的分子质量高、分散性指数降低，且分子质量分布向均一性转变。与原果胶分子质量相比（（109.98±0.05）kDa），接枝改性后的柑橘果胶分子质量明显下降，龙胆酸-柑橘果胶的分子质量降低至（65.11±0.02）kDa，丁香酸-柑橘果胶的分子质量最低，为（39.83±0.05）kDa。这是由于自由基介导接枝反应过程中产生的自由基夺取了果胶内的氢原子，氢键作用力减弱，导致柑橘果胶分子的主链或支链断裂，使改性后的果胶形成较小的分子片段，从而降低了分子质量[11]。Wei Zihao[22]和Woranuch[23]等使用自由基介导接枝合成酚酸-壳聚糖接枝共聚物，发现酚酸-多糖接枝共聚物的分子质量比壳聚糖低，与本研究结果一致。

2.3 酚酸-柑橘果胶接枝共聚物的酯化度、半乳糖醛酸含量、溶解度分析

图2 原果胶及酚酸-柑橘果胶接枝共聚物的酯化度（A）、半乳糖醛酸质量分数（B）和溶解度（C）Fig. 2 Esterification degrees (A), galacturonic acid contents (B) and solubility (C) of pectin and phenolic acid-citrus pectin copolymers

由图2可知，与原果胶相比，接枝改性果胶的酯化度、半乳糖醛酸含量和溶解度均有所增加。原果胶酯化度为（51.62±1.46）%，属于高甲氧基果胶（酯化度＞50%），龙胆酸-柑橘果胶酯化度增加至（70.83±1.64）%，丁香酸-柑橘果胶酯化度增加至（72.73±2.18）%。这主要是由于H2O2体系在反应过程中产生的自由基夺取了果胶内的氢原子，接枝后酚酸的羧基脱去氢氧根后，与原果胶脱氢的羟基发生酯化反应形成甲酯基，导致接枝物中甲酯基增多，使接枝共聚物的酯化度升高[24]。

由图2B可知，相比于原果胶（半乳糖醛酸质量分数为（39.18±1.08）%），改性后的龙胆酸-柑橘果胶半乳糖醛酸质量分数增加到（52.42±1.36）%，丁香酸-柑橘果胶半乳糖醛酸质量分数增加到（53.88±1.19）%。这可能是由于改性过程中多聚糖醛酸解聚以及脱除了中性糖及部分杂质，从而导致半乳糖醛酸含量的增加[19]。

由图2C可知，接枝改性后的果胶溶解度比原果胶的溶解度增加了约20%，由（39.34±1.08）%分别增加至（54.40±1.05）%和（59.87±1.21）%，这主要是由于接枝改性过程中自由基夺取了果胶内的氢原子，使氢键作用力减弱、疏水性减小、溶解度增加[21]。

结合图1可知，随着接枝改性后果胶分子质量下降，接枝改性果胶的酯化度、半乳糖醛酸含量和溶解度都有所增加。Samuels[25]的研究发现，接枝改性后的果胶分子质量通常与酯化度、半乳糖醛酸含量和溶解度呈负相关，酯化度、半乳糖醛酸含量与溶解度呈正相关，与本研究结果一致。

2.4 酚酸-柑橘果胶接枝共聚物的傅里叶变换红外光谱分析

图3 原果胶及酚酸-柑橘果胶接枝共聚物的傅里叶变换红外光谱图Fig. 3 Fourier transform infrared spectra of pectin and phenolic acid-citrus pectin copolymers

由图3可知，与原果胶相比，不同种类的酚酸-柑橘果胶接枝共聚物的峰形相似，说明改性柑橘果胶的糖类型未改变，改性前后的基本结构未发生明显变化。在3 450 cm-1波数附近的宽吸收峰来自—OH和—NH2的不同强弱的分子内或分子间的O—H伸缩振动；2 930 cm-1波数处的吸收峰为多糖C—H伸缩振动，包括—CH、—CH2、—CH3内的伸缩振动[22]；1 740 cm-1和1 625cm-1波数处是果胶的特征峰，分别为酯化的羧基官能团吸收峰和自由羧基官能团吸收峰。1 740 cm-1波数处的特征峰可用于区分果胶酯化度的高低。由图3可知，相比于原果胶，接枝改性果胶在1 740 cm-1波数处的吸收峰增强，说明改性后的柑橘果胶酯化度升高，与图2一致。此外，接枝改性后，果胶图谱中1 420 cm-1波数处（—CH2弯曲振动）的吸收峰明显减弱，表明C-6位的—CH2消失，证明C-6位可能为果胶的反应活性位点[26]。另外，接枝改性果胶在1 510 cm-1和1 360 cm-1波数处出现了新的吸收峰，分别为酚酸芳香环的C＝C拉伸以及新C—N共价键的生成[27]。这些结果也说明酚酸与柑橘果胶接枝成功，并且酚酸主要以共价形式接枝到果胶链上。

2.5 酚酸-柑橘果胶接枝共聚物的扫描电子显微镜分析

图4 原果胶及酚酸-柑橘果胶接枝共聚物放大500 倍（A）和1 000 倍（B）的扫描电子显微镜图Fig. 4 Scanning electron micrographs of pectin and phenolic acidcitrus pectin copolymers at × 500 (A) and × 1 000 (B) magnification

由图4可知，原果胶显示出相对粗糙且致密的块状结构，表面呈现内凹型、部分团聚、质地较厚；经酚酸接枝改性后果胶表现出片状结构，其表面相对光滑、质地较薄、松散且部分卷曲。接枝过程中，在自由基的作用下柑橘果胶分子间与分子内部的氢键作为连接作用被极大减弱，可能导致接枝改性后的果胶形态发生了明显变化。

2.6 酚酸-柑橘果胶接枝共聚物的单糖组成分析

表2 原果胶及酚酸-柑橘果胶接枝共聚物的单糖组成Table 2 Monosaccharide compositions of pectin and phenolic acid-citrus pectin copolymers

由表2可知，柑橘果胶原料分子中的主要包括葡萄糖、半乳糖醛酸，鼠李糖、半乳糖和甘露糖等9种单糖。接枝改性没有改变柑橘果胶的单糖种类，但使其单糖含量发生一定变化。接枝改性后，除了葡萄糖和甘露糖含量降低外，其余单糖含量均有所增加。半乳糖醛酸含量从3.39%分别增加到28.91%和30.19%，这与图2中半乳糖醛酸含量变化趋势一致，这也说明在自由基介导的酚酸改性过程中，柑橘果胶的半乳糖醛酸主链不易被降解[28]。此外，接枝改性后，葡萄糖和甘露糖含量降低主要是自由基使柑橘果胶分子的葡萄糖或甘露糖之间以及与半乳糖醛酸之间的连接被打断，被降解成寡糖并在透析过程中被除去所致[29]。

2.7 酚酸-柑橘果胶接枝共聚物的热分析

由图5A可知，样品的热解过程可分为以下阶段[30-31]：第1阶段（100～200 ℃）有一个小的质量损失过程，主要损失的物质为原果胶及接枝共聚物中的结合水和结晶水，此过程为吸热反应；第2阶段在200～400 ℃，为原果胶和接枝共聚物的主要降解阶段，可以看出柑橘果胶受热分解导致质量的快速损失，半乳糖醛酸链首先开始大量热降解，糖苷键被打断；第3个阶段（400～800 ℃）是由柑橘果胶碳骨架的降解所引起，当温度达到800 ℃，原果胶、龙胆酸-柑橘果胶和丁香酸-柑橘果胶中残留的灰分比重分别是11.75%、22.64%和38.60%，表明样品降解速率为原果胶＞龙胆酸-柑橘果胶＞丁香酸-柑橘果胶。此外，图5B中的峰代表样品的最大分解速率，原果胶、龙胆酸-柑橘果胶和丁香酸-柑橘果胶的最大分解速率对应的温度分别是325、265 ℃和255 ℃。这些结果表明，酚酸-柑橘果胶接枝共聚物的热稳定性比原果胶差。Pasanphan等[10]在制备壳聚糖衍生物的研究中发现，没食子酸接枝到壳聚糖上会使原本壳聚糖结构链的排列方式发生变化，导致其热稳定性下降，与本研究结果一致。

图5 原果胶及酚酸-柑橘果胶接枝共聚物的热重（A）和差示扫描量热曲线（B）Fig. 5 Thermogravimetric (A) and differential scanning calorimetric curves (B) of pectin and phenolic acid-citrus pectin copolymers

3 结 论

通过VC/H2O2氧化还原体系将5种酚酸接枝到柑橘果胶的分子链上，形成酚酸-柑橘果胶接枝共聚物，其中丁香酸-柑橘果胶接枝度最高，为（74.2±1.38）mg/g，其次为龙胆酸-柑橘果胶接枝度，为（67.24±1.55）mg/g。与原果胶对比发现，自由基介导接枝反应过程中产生的自由基夺取了果胶内的氢原子，使酚酸接枝改性后的柑橘果胶分子质量下降并向均一性转变，而酯化度、半乳糖醛酸含量和溶解度增加，其中，使用龙胆酸和丁香酸接枝改性后的果胶溶解度比原果胶的溶解度增加了约20%，由（39.34±1.08）%分别增加至（59.87±1.21）%和（54.40±1.05）%。接枝反应过程中，酚酸主要以共价形式接枝于柑橘果胶链上，且并未破坏柑橘果胶的主要化学结构，使其微观结构形成更加光滑平整的片状结构，但酚酸接枝改性后柑橘果胶的热稳定性低于原柑橘果胶。