慢速与快速生物监测理论与实践研究进展

伴随着科学技术的飞速发展和全球人口老龄化的进程加剧，全球医疗机构正在面临前所未有的诊疗服务压力。院内感染的有效控制作为提供服务的先决条件，自始至终都是医疗机构日常工作的重中之重[1]。消毒供应中心作为医疗机构中承担各科室所有重复诊疗器械、器具和物品清洗、消毒、灭菌以及无菌物品供应的部门，在很大程度上决定着可能由医疗器械、器具和物品等引发的院内感染几率高低，是院感控制的关键科室，因此，其每一个操作步骤都应该引起院感管理者的充分重视[2]。灭菌作为彻底杀灭器械表面、内部等结构中残留微生物的再处理操作，是消毒供应中心器械无菌储存与发放前的最后一个操作步骤，更是保护器械再处理质量的最后一道“屏障”。我国卫生行业标准《WS 310.3-2016 医院消毒供应中心 第3部分：清洗消毒及灭菌效果监测标准》[3]提出，针对器械灭菌，应按照不同灭菌方式所要求的监测频率，进行灭菌效果的生物监测，生物监测结果不合格时，对应灭菌器械不予放行。目前，医疗机构所使用的生物监测方式，按照监测时间、判读原理等原则区分，存在着慢速和快速生物监测两种类型，其在得到广泛使用的同时，对应的可靠性问题引起了业内的普遍关注，其可以直接影响到医疗机构器械再处理的效率和院感控制的风险。文章对该领域进展综述如下。

1 慢速与快速生物监测的发展

1881年，德国医学家Koch[4]首先针对引发炭疽热感染的、对灭菌条件产生较强抗力的细菌芽孢进行研究，其提出天然土壤中的芽孢相较炭疽杆菌适宜培养基中产生的芽孢对于灭菌条件有更强的抗力，自此，相关科学家逐渐形成共识：如果一种灭菌方式能够杀灭抗力最强的细菌形式，可以认为其能够杀灭其他的生命体形式，此即为生物监测的设计理论基础。经过长时间的发展，1957年，全球首个商业化的生物指示物问世并被应用于医疗机构[5]。首先推广使用的是第一代生物监测产品，其对应的生物指示物将已接种的菌片置于包装中，随后统一放入灭菌设备中进行灭菌，在无菌条件下实现生物指示物的取出和培养，时间需要7 d，以培养基的浑浊状态为灭菌结果的判定标准。

第二代生物监测产品，其设计采用自含式包装方法，将已接种的菌片和培养基同时封装于一个初级包装中，在灭菌之前两者互不接触，灭菌后不需无菌条件操作，培养时间通常为1～7 d，以培养基颜色变化为灭菌结果的判定标准，由于培养时间仍需要1 d以上，因此其被认为是普遍意义上的慢速生物监测。第三代生物监测产品，其包装方法与第二代产品相同，通过培养基体系中非荧光化合物的添加，实现培养时间的缩短，通常在数小时甚至1 h内，以机器判读的荧光反馈结果为灭菌结果的判定标准，由于可以实现极高的判读效率，其被认为是普遍意义上的快速生物监测。

第一代生物监测产品由于需要为期7 d的微生物培养，无法满足目前医疗机构器械使用快速周转的需求，在一线消毒供应中心中已停止使用。慢速生物监测产品能够在很大程度上缩短微生物培养时间，同时判读方式比较简单直接。因此，其在医疗机构中得到了长期广泛使用。快速生物监测产品在判读时间上真正帮助医疗机构实现了快速的灭菌周转和有据放行，目前正在整个行业内逐步替代慢速的生物指示物。

2 慢速与快速生物监测判读原理及验证要求

慢速生物监测以自含式生物指示物内培养体系中的酸性物质为考察对象，如果其含量达到一定浓度，可以使预先存在于液体培养基中的酸碱指示剂发生视觉上可以观察到的颜色变化，进而指示灭菌结果。酸性物质为细菌整个生长周期中主要的代谢产物，不同细菌根据产酶种类的不同，对培养基中主要的糖类或醇类供能物质进行针对性发酵，用于自身供能，同时产生酸性代谢产物，部分细菌同时会产生气体代谢物。快速生物监测以自含式生物指示物内荧光物质为考察对象，首先使用特定外置光源对自含式生物指示物细菌培养区域进行激发，荧光物质受激发后发出的荧光可以被荧光接收器捕捉，进而通过机器后台计算指示灭菌结果。荧光物质由培养体系中非荧光底物转化生成，而根据相关研究[6-9]，目前非荧光底物的转化主要通过微生物糖类代谢中的重要物质α-葡萄糖苷酶或β-磷酸葡萄糖苷酶实现。

美国FDA在《Guidancefor Industryand FDA staff：Biological Indicator（BI）Premarket Notification [510（k）] Submissions》中提出，“通常情况下，FDA推荐7 d作为生物指示物指示灭菌程序的传统培养时间”“一个生物指示物的培养时间可以少于传统的7 d甚至更长的培养时间，前提是根据合适的方法验证出的缩短后的培养时间对于判定灭菌过程有效性是充分的”[10]。在该指南中，FDA推荐了相关的方法以及最低的批次阳性率一致性要求。Laszlo等[10]对FDA推荐的验证方法进行了详细的分析阐述，其认为FDA使用的“Most Probable Number”假设方法（MPN法）是具有统计学依据的，其规定的97%及以上的批次一致性能够很好地保证指示效果。我国卫生行业标准《WS628-2018 消毒产品卫生安全评价技术要求》中，生物指示物的必检项目中并未包含指示结果一致性对比。但从实际情况来看，目前我国行业内生物指示物的安评报告中均已加入了缩短后的培养时间和7 d培养结果的一致性对比。

3 慢速与快速生物监测应用争议

目前，行业内对于慢速生物监测的判读原理及指示结果的认可度较高。以常见的压力蒸汽灭菌生物指示物为例进行分析，根据相关研究，其选用嗜热脂肪芽孢杆菌作为标的微生物，该菌种在代谢过程中中产酸不产气。该体系中，培养基通常选用pH值为7.2的溴甲酚紫葡萄糖蛋白胨水培养基[11]。溴甲酚紫作为常见的酸碱指示剂，其指示条件为pH值＞6.8时显示紫色，pH值＜5.2时显示黄色[12]。对于自含式生物指示物，由于其可以在一定程度上做到有效的污染物屏蔽，因此可以确信培养体系pH值的大幅降低是细菌生长过程中产生的酸性代谢产物造成的结果。

同时，行业内对于快速生物监测的应用存在争议，问题的焦点主要集中于和判读原理相关的几个方面。

3.1 特种酶和芽孢生理活动的对应关系

以压力蒸汽灭菌生物指示物所用嗜热脂肪芽孢杆菌为例，其产生α-葡萄糖苷酶用于非荧光底物糖苷键的切断。α-葡萄糖苷酶对于微生物的糖类代谢具有重要作用，其在几乎所有的生命体内均广泛存在，在成熟细胞中含量较高[13]。Mphahlele等[14]通过研究表明微生物产生的α-葡萄糖苷酶可以分为胞内酶、细胞结合酶和胞外酶3种类型。根据考虑到自含式生物指示物菌片负载芽孢的制备工艺，在产品使用之前，载体菌片上很有可能是同时含有以上3种类型。

Peytam等[15]对于α-葡萄糖苷酶的活性进行了深入研究，其发现胞外酶会在98℃、30 min的热激活条件下损失绝大部分的活性，考虑到目前一线临床使用的灭菌器程序，可以认为经历完整灭菌程序的载体菌片上胞外酶已完全失去活性，同时，其发现α-葡萄糖苷酶同时存在于位于不同生理周期的芽孢的外层芽孢被、内层芽孢被和芽孢核中，如果胞外酶已经完全失去活性，则芽孢必须向胞内摄取糖类底物才能发挥α-葡萄糖苷酶的水解特性。Hussain等[16]通过免疫电镜观察到对于休眠状态下的嗜热脂肪杆菌芽孢，α-葡萄糖苷酶主要位于芽孢原生质外的芽孢被中。Laaroussi等[17]研究显示α-葡萄糖苷酶的最适温度为80℃以下，因此在真实的灭菌条件下，假设芽孢的整个细胞结构，包括含有遗传物质的芽孢核、芽孢皮、芽孢内外胞被统一破坏，则α-葡萄糖苷酶也会因为失去结构保护而快速失活；假设芽孢的部分结构被破坏，此时芽孢残留完整结构中的α-葡萄糖苷酶依然有可能发挥催化作用。

3.2 慢速和快速生物监测指示结果一致性

结合微生物培养时间相关文献研究及中美不同地区实际要求[15-19]，可以认为无论是慢速生物指示物还是快速生物指示物，其对应培养时间均非权威认定的时间标准，在生物指示物上市前，均有必要进行一致性验证试验。吴千惠等[5]的研究显示，402次快速生物监测与慢速生物监测结果具有高度一致性，且快速生物监测能够显著提升监测速度，降低监测成本。但也有研究报道，慢速和快速生物监测指示结果出现不一致是被接受的情况[20-21]。

对于慢速生物监测，指示物的变色需要依托以下两个过程：（1）存活芽孢在合适的生长环境下，进行活化、出芽、生长和繁殖等一系列生理活动，向环境中分泌大量的酸性代谢产物；（2）足量的酸性代谢产物引起的pH变化足够跨越显色剂的变色区间。对于快速生物指示物，阅读机器通过预先的程序设定，对于早期的荧光捕捉具有高度敏感性，此时体系中对应的芽孢数量较少，生理周期也处于早期阶段。

慢速和快速生物监测结果不一致的情况，往往表现为慢速指示结果阴性、快速指示结果阳性的情况。针对此类情况，第一种可能性是灭菌过程有效性处于临界状态，体系中残留的、具有活性的芽孢数量极少，其无法通过规定时间内的培养达到足以使慢速生物指示物变色的微生物数量[22]；第二种可能性是体系内有少量残留芽孢且其部分结构已经被破坏，同时还有残留α-葡萄糖苷酶或芽孢依然在合成α-葡萄糖苷酶；第三种可能性是体系内所有芽孢已经灭活，全部结构被破坏，同时还有残留α-葡萄糖苷酶[23]。通过前述分析，第三种可能性发生概率极低，灭菌的整个过程必须经过非常精细的条件设计和真实呈现才会形成此类情况。

3.3 阳性判读结果的认知

刘晨鸣等[24]的研究分析，对于慢速生物监测，当有阳性监测结果呈现时，体系内同时已经含有大量的处于对数期、稳定期的细菌，提示对应灭菌过程不能提供所要求的灭菌保障水平。而对于快速生物监测，首先，其监测结果已经按照不同要求与7 d培养结果进行一致性的对比，虽然其可能同慢速监测结果不符，但理论上应该以7 d监测结果的对比数据为准[25]。其次，虽然其可能在后续的慢速培养中显示阴性结果并提示芽孢无法完成正常的细菌生理周期，但指示标准菌种的残留已提示出器械可能表面微生物残留，其是否能在人体环境下完成生理周期并显示致病性应该引起重视。最后，有条件的医疗机构应该通过相应的检验方法确定指示物中芽孢的残留情况和生理状态。

4 快速生物指示物的应用现状

自快速生物指示物问世以来，许多医疗机构都将其应用于日常灭菌监测及科学研究当中。蔡海燕[26]通过为期6个月的试验对比，证实快速生物指示物能够明显缩短器械周转时间和生物监测阳性召回工作量，而不同型号的生物监测产品无统计学意义上的阳性率差异；尹翔宇等[27]通过分析科室生物监测失败的原因，认为快速生物监测能够给临床带来极大便利，但需要通过严格规范操作来确保得出准确的监测结果，避免“假阳性”事件的发生；马仕洪等[28]通过对比试验发现传统的菌片式生物指示物容易受到污染物影响，而其他多个品牌的慢速及快速生物指示物能够避免“假阳性”结果的产生，且指示结果之间没有明显差异。万莉等[29]在对快速生物指示物的应用过程当中，给予了其高度评价，该团队认为可能的“假阳性”结果和灭菌器的性能有密切关系。

5 小结

综合分析相关国内外研究文献，慢速与快速生物监测均具备相当的且合理的理论基础，且正在被国内外医疗机构广泛应用于日常工作和科学研究当中，为相关单位提升器械再处理水平、提高器械再处理质量和降低院感事件发生率做出了相应的贡献，应当针对其使用价值给予肯定。与此同时，行业内出现的应用争议主要在于困扰一线临床使用者的监测结果准确性问题，慢速与快速生物指示物的监测结果同微生物残留水平的对应关系还无法做到实时验证，如何规范检测水平、开发实时微生物检测技术也是下个阶段需要研究人员深入探索的问题。