一种创新病理冰冻切片的冰锤组件及染色加热组件在甲状腺术中冷冻切片中应用

傅杭州 方庆全 陈宏 厦门大学附属第一医院病理科 （福建 厦门 361003）

内容提要： 目的：优化甲状腺术中冷冻切片技术关键环节，以期提高其制片质量。方法：分别比较甲状腺术中冷冻切片工作中不同速冻方法、固定方式与苏木素染色方法等对制片质量的影响。速冻方法中，使用专利冰锤时，将套筒立于冰冻托头的四周，通过螺纹将冰锤旋入套筒内，经观察窗观测组织的厚度，旋转冰锤操纵部使冰锤下降至与组织面接触即可。苏木素染色方法中，使用专利加热组件染色时，在染色杯中倒入适量的苏木素，将染色杯放入预热至50˚C的水浴箱中，用染色架承载冰冻切片后，放入染色杯中染色30s即可。结果：专利冰锤的速冻时效为（63.72±1.49）s，与冷冻切片机自带冰锤的（63.07±1.44）s无显著差异；但专利冰锤速冻条件下的组织完整性得分为（8.79±0.10）分，显著优于后者的（7.96±0.14）分。冷冻切片切片后立即放入AAF液内固定30s组的细胞核染色强度、细胞质染色强度、核质浆对比度3项指标的得分均显著高于室温放置20s后固定组与用热风吹干后固定组（P均<0.05）。冷冻切片使用专利加热组件染色优良率为96.9%（155/160），高于用乙醇灯加热的91.3%（146/160）（0.01

近年来，随着术中冷冻切片研究的不断深入，冷冻切片已经被广泛应用于术中病理诊断，指导临床医师制定手术方案与确定手术范围[1,2]。新鲜甲状腺组织由于血管丰富、质地较软、囊肿多见，其冷冻切片制片难度显著高于其他组织，易出现切片不完整、组织结构模糊、细胞肿大、细胞核染色不清晰、细胞质染色不清晰、核质对比度差等不良现象，进而影响病理诊断质量。为此，作者对甲状腺冰冻切片的几个重要步骤过程进行优化，以期提高制片质量与诊断水平，指导临床术中确定正确的手术方案。

1.材料与方法

1.1 一般材料

随机抽取本科室2021年7月～2021年12月的甲状腺冷冻切片标本。

仪器设备：一种病理冰冻切片的冰锤组件（专利证书号第3445758号）：由冰锤与套筒组成（图1），冰锤外侧面设有与套筒内侧面相互吻合的螺纹，套筒设有观察窗，冰锤设有操纵部。使用时，将套筒立于冰冻托头的四周，通过螺纹将冰锤旋入套筒内，经观察窗观测组织的厚度，旋转冰锤操纵部使冰锤下降至与组织面接触即可。此时冰锤底面处于水平状态。

图1.一种病理冰冻切片的冰锤组件（注：①套筒；②冰锤）

一种病理冰冻切片的染色加热组件（专利证书号第3399678号）：由电热恒温水浴箱、不锈钢杯和染色架组成（图2）。使用时，在染色杯中倒入适量的苏木素，将染色杯放入预热至50˚C的水浴箱中，用染色架承载冰冻切片后，放入染色杯中染色30s即可。

图2.一种病理冰冻切片的染色加热组件（注：①电热恒温水浴箱；②不锈钢杯；③染色架）

主要试剂：包埋剂，AAF液（由95%乙醇：乙酸：甲醛=85:5:10组成），Harri苏木素染液。

1.2 方法

冷冻切片的制备。

1.2.1 速冻方法的比较

收集60例新鲜甲状腺标本，按张翠霞等[1]介绍的方法取2块甲状腺组织，放置于冰冻托头上，加适量的包埋剂，移至冷冻切片机的冷冻台，随机分为A、B 2组。A组组织放置于冷冻台后，立即在上方加盖专利冰锤组件以加快速冻；B组组织放置于冷冻台后，在上方加盖冷冻切片机配置的冰锤加快速冻。2组速冻后的组织均切取厚度为6µm的冷冻切片，切片后立即放入AAF液内固定30s，用一种病理冰冻切片的染色加热组件染苏木素后，水洗、分化、返蓝、染伊红、脱水、透明、中性树胶封固、显微镜观察。比较不同速冻方法条件下甲状腺组织冷冻切片的速冻时效与组织完整性。速冻时效：新鲜甲状腺组织被冻成冻块所耗的时间。

1.2.2 固定方式的比较

收集60例新鲜甲状腺标本，按A组的方法连续切片3片，随机分为C、D、E 3组，C组按A组的方法及时固定，余操作同A组；D组室温放置20s后固定，余操作同C组；E组用热风吹干后固定，余操作同C组。比较不同固定方式条件下甲状腺组织冷冻切片细胞核染色强度、细胞质染色强度、核质浆对比度3项指标的得分情况。

1.2.3 染色方法的比较

收集80例新鲜甲状腺标本，按A组的方法连续切片2片后固定，随机分为F、G组，F组按A组的方法染色及后续处理；G组染苏木素步骤改为“在载玻片组织面滴加苏木素，用乙醇灯从载玻片下方加热切片30s”，余操作同F组。比较不同染色方法的优良率与时效。

1.3 观察指标与判定标准

细胞核染色强度、细胞质染色强度、核质对比度各10分，评分标准如下：细胞核染色强、细胞质染色强、核质对比清晰，则各得分为10分；若切片细胞核染色较弱、细胞质染色较弱、核质对比较不清晰，尚不影响观察，减1～2分；若切片细胞核染色弱、细胞质染色弱、核质对比不清晰，一定程度上影响观察，减3～6分；若切片细胞核染色模糊、细胞质染色模糊、核质对比不清晰，严重影响观察，减7～10分。由2位质控师双盲评片，取其得分的平均值。

1.4 统计学分析

采用SPSS17.0进行分析，计数资料采用χ2检验，计量资料采用t检验，用±s表示，P<0.05为差异有统计学意义。

2.结果

2.1 速冻方法的比较

速冻时效性的比较：A组速冻时效为（63.72±1.49）s，B组为（63.07±1.44）s，两组比较，差异无统计学意义（P>0.05）。

组织完整性的比较：A组组织完整性得分（8.79±0.10）分，B组得分为（7.96±0.14）分，两组比较，差异有统计学意义（P<0.01）。

2.2 固定方式对甲状腺冷冻切片的影响

不同固定方式条件下甲状腺组织冷冻切片的染色结果见表1。由表1可见，E组细胞核染色强度、细胞质染色强度、核质对比度3项指标得分均优于D组与E组（图3）。

表1.不同固定方式甲状腺冷冻切片3项指标评分结果(n=60,±s,分)

表1.不同固定方式甲状腺冷冻切片3项指标评分结果(n=60,±s,分)

注：与C组比较， 0.01

组别 细胞核染色强度 细胞质染色强度 核质对比度C组 9.14±0.08 9.31±0.06 9.37±0.06 D组 8.67±0.09b 8.77±0.07b 9.16±0.06a E组 8.47±0.09b 8.65±0.07b 9.08±0.07b

图3.固定方式对甲状腺冷冻切片的影响（C：及时固定，细胞核染色强、细胞质染色强、核质对比清晰；D：放置20s后固定，细胞核染色较弱、细胞质染色较弱、核质对比较不清晰；E：热风吹干后固定，细胞核染色弱、细胞质染色弱、核质对比不清晰。）

2.3 染色方法对甲状腺冷冻切片的影响

染色优良率的比较：F组的染色优良率为96.9%（155/160），高于G组的91.3%（146/160），差异有统计学意义（χ2=4.53，0.01

染色时效性的比较：染1或2张冷冻切片时，F组染色时间为（298.1±1.89）s，G组为（302.7±1.92）s，差异不显著（P>0.05）。同时需要染3张切片时，F组染色时间显著短于G组[（303.6±2.07），（558.8±1.88）s，t=91.31，P<0.0001]。

3.讨论

冷冻切片是采用低温条件将新鲜组织快速冻成冻块后制作切片的过程，常用于术中快速病理诊断，可确定病变组织的性质，能够让外科医师在手术过程中根据快速病理诊断结果及时决定下一步的手术方式[3,4]。

甲状腺癌是目前较为常见的一种甲状腺恶性肿瘤，随着诊断甲状腺癌的医疗方法不断改变，甲状腺癌检出率逐年上升[5]。但甲状腺组织病理学形态差异较大，加之冷冻切片的制片质量对组织形态亦有显著的影响，为了提高甲状腺术中病理诊断准确率，优化其冷冻切片技术具有重要意义。

冷冻切片机已广泛应用于病理学冷冻切片的制片工作，通常冷冻切片机设计有冰锤，可用于加盖在需要速冻的组织上，使待冻组织能更快地冻成冻块。但是作者发现，冷冻切片机原配的冰锤设计上存在缺陷，冰锤加盖在待冻组织上后，多数待冻组织会发生倾斜，使部分组织受挤压而人为变形，从而导致冷冻切片组织结构不全，造成人为假象。为了解决冷冻切片机自带冰锤的缺陷，作者研发设计了“一种病理冰冻切片冰锤组件”，该专利冰锤具有如下优点：①套筒及冰锤使用比热容优质的材质制作，能较快和较持久地加速待冻组织速冻；②冰锤组件配合使用时，套筒上设置的可视窗可观察冰锤下降的所在位置，可准确地根据组织厚度调整冰锤的高度，保证冰锤不挤压待冻组织的前提下有效缩短速冻时间，从而既能减少冷冻切片产生冰晶与裂隙，又避免挤压组织，提高组织完整性。

固定是冷冻切片制作过程的一个重要步骤，固定可使组织与细胞保持或尽量接近原有的形态，使水溶性物质扩散，抑制细胞内酶的活性，保持细胞膜的完整性，防止切片模糊；固定还能使组织中各物质凝固与沉淀后产生不同的折射率，使染色后的切片有利于观察。因此，甲状腺组织冻块切片后应及时、有效地固定，才能破坏或有效抑制组织细胞内各种酶的活性，沉淀蛋白，防止组织腐败与自溶，防止滤泡腔内胶质脱落，减少上皮细胞皱缩，最大限度地缩小显微镜下冷冻切片与常规石蜡切片在组织细胞形态上的差异。有些制作甲状腺冷冻切片的病理技师没有事先准备好要贴冷冻切片的载玻片，而是先用载玻片贴了冷冻切片后，再在载玻片上标注病理号、患者姓名、病案号等信息，并且在固定前先观察冷冻切片是否切片完整、有无切到所需要观察的结节等，有的技师担心冷冻切片“湿固定”在后续染色过程中会脱片，将冷冻切片晾干后再固定。作者实验发现，甲状腺冷冻切片立即固定并不会增加脱片的概率；而冷冻切片在室温晾20s后再固定，其切片按相同程序染色后细胞核染色较弱、细胞浆染色较弱、核浆对比较不清晰；用热风吹干后固定，由于电热吹风干燥、高温，对甲状腺组织造成较为严重的影响，也导致染色效果较差。

冷冻切片染色易受染液温度、试剂浓度、染色时长、环境、操作习惯等因素影响，其中苏木素染色是至关重要的环节。冷冻切片苏木素染色环节传统方法通常需要用时2～4min，为了缩短苏木素染色时间，许多病理技师会在冷冻切片组织面滴加苏木素，然后用乙醇灯从载玻片下方加热。乙醇灯加热载玻片能使载玻片上的苏木素温度升高，加快苏木素染色。但是该方法存在以下缺点：玻璃导热速度慢，苏木素温度上升速度难以控制，苏木素温度无法监测，乙醇灯的火焰范围小造成一次仅能染色2张片，不稳定的温度易导致苏木素氧化膜析出造成污染。上述缺陷导致冷冻切片染色质量优劣不一。作者设计了一种病理冰冻切片的染色加热组件（专利证书号：第3399678号），具有显著的适用性：①水浴加热可设置恒定的、合理的苏木素染色温度，对缩短苏木素染色时间提供了基础；②采用不锈钢材质制作染色杯，具有导热速度快的优点，可显著缩短苏木素染液从室温上升至设定温度的时间；③染色杯设计为方形高杯，与染色架及载玻片的形状相吻合，可很大程度地节约染液的用量；④不锈钢杯与染色架均不易受热变形，可重复使用，经济实惠；⑤不锈钢杯与染色架的规格大小可以根据冷冻切片通常需要的染色片数进行调整，具有很强的实用性。因此，使用一种病理冰冻切片的染色加热组件进行甲状腺冷冻切片苏木素染色，能高效、及时、高质量地完成冷冻切片的染色，为甲状腺术中快速病理诊断及时性、准确性提供保障。

本研究结果表明，在甲状腺术中冷冻切片制作过程中，使用专利冰锤显著优于冷冻切片机自带的冰锤；切取甲状腺冷冻切片后需及时、正确的固定；使用一种病理冷冻切片的染色加热组件进行苏木素染色效果更佳。