红景天苷对小鼠脑缺血再灌注损伤保护作用及其机制

王建宇 高倩 张莉 王勇朝 崔永健 魏琰 (衡水市人民医院神内二科,河北 衡水 053000)

缺血性脑卒中表现为高发病率、高致残率及高死亡率的三高特点,给社会和患者家庭造成极大的精神及经济压力〔1～3〕。正常大脑的血管被堵塞后,造成血液供应被中断,进而造成局部脑组织缺血缺氧,最终导致脑细胞的坏死或凋亡等〔4,5〕,即使在一定时间内血液供应得以恢复,但大脑的功能却不能得到及时的恢复,反而会加重脑神经的功能障碍,即脑缺血再灌注损伤〔6,7〕。目前,针对缺血性脑卒中仍没有十分有效的治疗方案,近年来,药物性保护成为临床医学关注的治疗方案之一〔8～10〕。

红景天苷是来源于红景天的一种有效的生物活性成分,是我国十分珍贵的传统中药之一,拥有悠久的药用历史〔11～13〕。研究表明,其具有抗氧化作用,可抑制脑缺血再灌注后的炎症反应,改善缺血再灌注后的神经功能缺陷,对脑组织发挥保护作用〔14～16〕。红景天苷对小鼠脑缺血和脊髓损伤均具有保护作用,并且这种保护作用的机制是通过调控小胶质细胞的偏振分化而发挥作用〔17,18〕。脑缺血再灌注后红景天苷对脑组织的保护机制鲜有报道,因此本文通过建立小鼠大脑中动脉缺血再灌注模型,观察红景天苷对脑组织的保护作用,并对其可能的作用机制进行探讨。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 动物 8～12 周龄SPF 级C57/BL6 小鼠(22±25 g) 购自河北医科大学实验动物中心。

1.1.2 药品与试剂 红景天苷由河北中医药科学院提供,纯度大于95%;2,3,5-氯化三苯基四氮唑(TTC)购自Sigma (T8877);动物组织总RNA 提取试剂盒(天根生化科技有限公司;DP431);cDNA 第一链合成试剂盒(天根生化科技有限公司;KR103-03);SYBR Green(天根生化科技有限公司;FP209);B 淋巴细胞瘤(Bcl)-2 抗体(CST 15071);Bcl-2 相关X 蛋白(Bax)抗体(CST 14796);cleaved-半胱氨酸蛋白酶(Caspase)-3 抗体(CST 9664);神经元核抗原(Neun)抗体(CST 12943);细胞色素(Cytochrome)C 凋亡检测试剂盒(Biovision K257-100);TUNEL 凋亡检测试剂盒(Roche 11684817910)。

1.1.3 仪器 冰冻切片机(Leica CM1950);线栓(Doccol,602156PK5Re);激光多普勒血流仪(Peri-Flux5001);通用型小动物麻醉机(瑞沃德R500);体温维持仪(瑞沃德69020);体视显微镜(Olympus SZX7);激光扫描共聚焦显微镜 (Olympus,FV3000);荧光定量PCR 仪(ABI 7500).

1.2 实验分组 为筛选出红景天苷的最佳剂量,两大组实验被设计。实验一:大脑中动脉阻塞60 min再灌注后,分别通过尾静脉注射不同剂量的红景天苷〔2.5,5.0,10.0,20.0 mg/(kg·d)〕及同体积的磷酸盐缓冲液(PBS),连续注射3 d。第3 天进行神经功能缺陷评分,根据评分结果筛选出红景天苷的最佳剂量。实验二:实验分为假手术(Sham)组、MCAO+Vehicle 组、MCAO+Sal 组,再灌注后及时通过尾静脉注射红景天苷,Sham 组和MCAO + Vehicle组注射相同体积的PBS。

1.3 MCAO 模型制作 气体麻醉后,固定于加热板上,使小鼠体温维持在(37±0.5)℃,立体显微镜下,在颈部中间剪一小口,钝性分离肌肉,暴露出左侧颈总动脉(CCA),钝性分离并打活结,继续往内上方分离出颈外动脉(ECA),远心端打死结,近心端打活结,外下方分离出颈内动脉(ICA),用动脉夹夹闭,在颈外动脉的近心端与远心端中间处剪一小口,将线栓从此处插入颈内动脉,避开翼额动脉,线栓头端距颈动脉分叉处9～10 mm 感觉有轻微阻力时停止。通过多普勒血流仪(Peri Flux System 5000,Perimed) 判断血液流速,下降至70%～80%即为模型成功,缺血60 min 后将线栓轻轻抽出再灌注,缝合切口,待小鼠苏醒后,放回饲养笼中,进行后续实验。Sham 组操作同上,不插入线栓。

1.4 免疫荧光染色 小鼠麻醉致死,灌流固定,30 μm冰冻切片,PBS 洗5 min 3 次,5%BSA 室温封闭1 h,PBS 洗,一抗4℃孵育过夜,PBS 洗5 min 3 次,二抗室温孵育1 h,PBS 洗5 min 3 次,4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)染核5 min,PBS 洗涤,封片镜检。

1.5 Western 印迹 小鼠麻醉致死,冷PBS 灌流,取半暗带组织,提取组织总蛋白,BCA 法测蛋白浓度,变性。按各组蛋白浓度等质量上样,十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE),转膜,5%脱脂奶粉室温封闭1 h,一抗4℃孵育过夜,PBST 洗5 min 3 次,二抗室温孵育2 h,PBST 洗5 min 3 次,加发光液,暗室曝光,扫描仪对胶片进行扫描,获取清晰条带图片,Image J 进行灰度分析。

1.6 脑梗死体积测定 小鼠麻醉致死,冷PBS 灌流,取脑,-20℃冷冻10 min,取出后放置小鼠脑槽中,1 mm 厚度连续6 片冠状切片,2%TTC 37℃孵育30 min,4%多聚甲醛(PFA)终止反应并固定,拍照。Image J 计算梗死区占对侧半球体积百分比。

1.7 qPCR 小鼠麻醉致死,冷PBS 灌流,取半暗带组织,液氮速冻,按动物组织总RNA 提取试剂盒操作步骤,提取组织总RNA,1.2%核酸胶检测RNA 完整性,并对RNA 浓度进行测定。按cDNA 第一链合成试剂盒操作步骤,反转录cDNA,上机进行qPCR 检测。

1.8 神经功能缺陷评分 参考Li 等〔19〕的14 分制,分别对再灌注后0、1、3、5、7、14、21 d 进行神经功能缺陷评分。

1.9 统计学方法 采用GraphPad Prism6 统计软件进行单因素方差分析、t检验。

2 结 果

2.1 缺血再灌注后不同剂量红景天苷对神经功能恢复的影响 2.5,5.0,10.0,20.0 mg/kg 的红景天苷与溶剂相比,对脑卒中后3 d 的神经功能恢复都有显著促进作用〔(8.856 ±0.325) 分、(7.700 ±0.227)分、(7.471±0.288)分、(6.043±0.201)分、(7.400 ± 0.324) 分;P＜0.05,P＜0.001〕, 但10.0 mg/kg的效果最好,表明10 mg/kg 为红景天苷的最佳剂量,这一剂量被用于之后的实验。

2.2 缺血再灌注后红景天苷减小了梗死体积,降低了神经功能缺陷评分 缺血再灌注3 d,与Sham 组相比,MCAO+Vehicle 组、MCAO+Sal 组均出现了明显梗死,神经功能缺陷明显。与MCAO+Vehicle 组〔(43.92±1.06)%〕相比,MCAO+Sal 组梗死体积〔(39.31±0.93)%〕显著减小(P＜0.01)。再灌注1、3、5、7、14、21 d 神经功能缺陷评分显著降低(P＜0.05)。见表1、图1。

表1 两组不同时间神经功能缺陷评分比较(±s,n=6,分)

表1 两组不同时间神经功能缺陷评分比较(±s,n=6,分)

与MCAO+Vehicle 组比较:1)P＜0.05

1 d3 d5 d7 d14 d21 d MCAO+Vehicle 组11.16±0.3110.17±0.329.84±0.358.31±0.218组别.00±0.376.50±0.43 MCAO+Sal 组8.83±0.311)8.50±0.221)7.83±0.261)6.67±0.191)5.35±0.231)4.17±0.341)

图1 缺血再灌注后红景天苷对梗死体积与神经功能缺陷的影响

2.3 缺血再灌注后红景天苷抑制了缺血半暗带神经元的丢失 缺血再灌注3 d,与Sham组相比,MCAO+Vehicle 组、MCAO+Sal 组缺血半暗带NeuN阳性细胞数显著减少(P＜0.001);与MCAO + Vehicle 组相比,MCAO + Sal 组缺血半暗带NeuN 阳性细胞数显著增多(P＜0.001),红景天苷抑制了缺血半暗带神经元的丢失。见表2、图2。

表2 缺血再灌注后红景天苷对缺血半暗带NeuN、TUNEL 阳性细胞数的影响(±s,n=4,个)

表2 缺血再灌注后红景天苷对缺血半暗带NeuN、TUNEL 阳性细胞数的影响(±s,n=4,个)

与Sham 组比较:1)P＜0.001;与MCAO+Vehicle 组相比较:2)P＜0.001

组别NeuNTUNEL Sham 组2 768.13±80.991.1825±0.39 MCAO+Vehicle 组299.61±19.141)507.09±9.971)MCAO+Sal 组691.79±42.811)2)314.67±9.871)2)

图2 缺血再灌注后红景天苷对缺血半暗带NeuN 阳性细胞数的影响(NeuN 染色,×200)

2.4 缺血再灌注后红景天苷抑制缺血半暗带脑细胞凋亡 缺血再灌注3 d,Sham 组未见TUNEL 阳性细胞的表达,MCAO+Vehicle 组、MCAO+Sal 缺血半暗带均能明显观察到TUNEL 阳性细胞表达。与MCAO+Vehicle 组相比,MCAO+Sal 组缺血半暗带TUNEL 阳性细胞的表达数量明显减少(P＜0.001)。见表2、图3。

图3 缺血再灌注后红景天苷对缺血半暗带TUNEL 阳性细胞数的影响(TUNEL 染色,×200)

2.5 缺血再灌注后红景天苷对缺血半暗带凋亡相关蛋白及mRNA 表达量的影响 缺血再灌注3 d,与Sham 组相比,MCAO+Vehicle 组、MCAO + Sal 组Bax、Cytochrome C、Caspase-3 蛋白及mRNA 表达量显著上升(P＜0.05),Bcl-2 蛋白及mRNA 显著性下降(P＜0.05)。与MCAO+Vehicle 组相比,MCAO+Sal 组的Bax、Cytochrome C、Caspase-3 蛋白及mRNA表达显著性下降,Bcl-2 蛋白及mRNA 显著上升(P＜0.05)。见表3、图4。

表3 缺血再灌注后红景天苷对缺血半暗带凋亡相关蛋白及mRNA 表达量的影响(±s)

表3 缺血再灌注后红景天苷对缺血半暗带凋亡相关蛋白及mRNA 表达量的影响(±s)

与Sham 组比较:1)P＜0.05;与MCAO+Vehicle 组比较:2)P＜0.05

组别Bcl-2蛋白(n=6) mRNA(n=4)Bax蛋白(n=6) mRNA(n=4)Cytochrome C蛋白(n=6) mRNA(n=4)Caspase-3蛋白(n=6) mRNA(n=4)7±0.031.00±0.210.14±0.021.00±0.30 MCAO+Vehicle 组 0.22±0.031) 0.31±0.241) 0.73±0.021) 1.96±0.311) 0.90±0.021) 3.37±0.361) 0.66±0.031) 2.37±0.401)MCAO+Sal 组0.37±0.021)2) 0.55±0.211)2) 0.39±0.021)2) 1.45±0.271)2) 0.51±0.031)2) 1.98±0.351)2) 0.53±0.021)2) 1.65±0.411)2)Sham 组0.77±0.031.00±0.230.27±0.011.00±0.250.2

图4 缺血再灌注后红景天苷对缺血半暗带凋亡相关蛋白表达量的影响

3 讨 论

红景天苷属于景天科植物红景天的一种有效的生物活性成分,是我国十分珍贵的传统中药之一,具有抗疲劳、抗衰老、免疫调节、清除氧自由基等多种药理作用。有文献报道红景天苷对心肌缺血具有保护作用,抑制心肌细胞的凋亡〔19～21〕。但脑缺血再灌注后红景天苷对脑组织的保护机制鲜有报道。本研究结果表明,红景天苷减小了缺血再灌注后缺血侧的梗死体积,同时降低了神经功能缺陷评分,证明了红景天苷对脑缺血再灌注具有保护作用。神经保护是治疗缺血性脑卒中的重要途径之一,本研究结果表明,缺血再灌注后红景天苷抑制了缺血半暗带神经元的丢失及脑细胞的凋亡。细胞凋亡是缺血再灌注后细胞的死亡方式之一,受多种基因与蛋白的调控〔22〕。Bcl-2 家族是目前研究较多的与细胞凋亡相关的基因家族,该家族中抗凋亡因子Bcl-2 和促凋亡因子Bax 在细胞凋亡过程起着促进与抑制的作用〔23〕。Cytochrome C 在凋亡中起着非常重要的作用,常被看作是凋亡的起始标志。此蛋白位于线粒体外膜和内膜间的空隙中,凋亡诱导物能引发Cytochrome C 从线粒体释放到细胞质中,并在此与凋亡酶激活因子(Apaf)-1 结合,Cytochrome C/Apaf-1 复合物激活Caspase-9,进而激活Caspase-3〔24〕。Caspases 是细胞凋亡过程中最重要的蛋白酶,凋亡的最后实施是通过Caspases 的激活而实现的,Caspase-3 是Caspases级联反应中下行的最关键的凋亡执行蛋白酶,其表达量的高低预示着凋亡程度的高低〔25,26〕。本研究结果表明,脑缺血再灌注后,红景天苷对脑细胞凋亡的抑制作用的其中一条途径是通过上调抗凋亡因子Bcl-2或下调促凋亡因子Bax 的表达,抑制Cytochrome C 从线粒体向细胞质的释放,进而下调Caspase-3 的表达,即通过抑制细胞凋亡的内源性途径而发挥对脑缺血再灌注损伤的保护作用。