外周血T淋巴细胞及双阴性T细胞在乳腺癌中的变化及临床意义

左永刚 刘家才 郭鑫 温玉清 夏书官 马明德(河南大学淮河医院甲状腺乳腺外科,河南 开封 475000)

全球2020 数据库显示,乳腺癌的发病率持续上升,已超过肺癌成为世界上最常见的恶性肿瘤,也是女性死亡的主要原因〔1,2〕。研究发现,免疫细胞从正常乳腺组织开始进行免疫监测,一直到原发性或转移性乳腺癌,其在整个乳腺癌发生、发展的过程中起关键作用〔3〕。近些年来,人们对免疫治疗领域的兴趣日益增加,也促进了对乳腺癌免疫微环境的深入研究,使得很多免疫细胞已成为临床相关性和高度重复性的生物标志物。本研究利用流式细胞技术检测乳腺癌患者及乳腺良性肿瘤患者外周血CD3+、CD4+、CD8+及双阴性T(DNT)细胞,探讨免疫细胞分布情况及临床价值。

1 材料与方法

1.1 一般资料 纳入2021年12月至2022年6月在河南大学淮河医院首诊住院治疗的女性乳腺癌(病理类型为浸润性非特殊癌)患者132 例为病例组,收集入院治疗前外周血T 淋巴细胞亚群及DNT细胞数值及比例,年龄、肿瘤大小、雌激素受体(ER)、孕激素受体(PR)、人表皮生长因子(HER)-2、Ki-67、分子分型、淋巴结转移情况、临床分期、组织学分级等;收集同时期医院100 例女性乳腺良性肿瘤患者为对照组。两组年龄、身高、体重、体重指数(BMI)差异无统计学意义(P＞0.05),见表1。

表1 两组基本情况对比(±s)

表1 两组基本情况对比(±s)

组别 n年龄(岁)身高(cm)体重(kg) BMI(kg/m2)132 49.9±10.5 159.1±5.0 62.1±10.524.5±3.8对照组100 47.6±11.4 160.1±5.661.5±9.824.0±3.7 t 值P 值病例组-1.57 0.118-1.45 0.147 0.44 0.605 1.03 0.304

1.2 仪器与试剂 流式细胞仪BD FACSCanto、DT5-3 型低速台式自动平衡离心机、微量移液器、CD3-FITC 荧光单克隆抗体试剂、CD4-PC7 荧光单克隆抗体试剂、CD8-APC-Cy7 荧光单克隆抗体试剂、10 倍溶血素。

1.3 实验方法 所有患者晨起及空腹条件下静脉穿刺外周全血样本2～5 ml,采用乙二胺四乙酸(EDTA)-K2 抗凝后室温存放,样本要求室温且避免震荡,血液采集后24 h 内使用。流式细胞术步骤:①在流式管底部加入20 μl CD3、CD4、CD8 试剂;②采用反向移液技术吸取50 μl 混匀的EDTA-K2 抗凝全血,加入管底,避免血液碰到管壁上部;③盖上管帽,轻轻涡动混匀约3 s,室温避光反应15～25 min;④向管内加入450 μl 血细胞分析用溶血剂;⑤盖上管帽,轻轻涡动约10 s,室温避光孵育15 min;⑥加入绝对计数微球后,上机检测。检测结果通过流式细胞仪分析软件自动分析获得。

1.4 统计学方法 采用SPSS25.0 软件进行t检验、Mann-WhitneyU检验、Kruskal-WallisH检验,采用受试者工作特征(ROC)曲线探究诊断价值。

2 结 果

2.1 两组外周血T 淋巴细胞亚群及DNT 细胞比较病例组CD3+T 细胞、CD4+T 细胞、DNT 细胞绝对值低于对照组,而CD8+T 细胞绝对值高于对照组,差异均有统计学意义(均P＜0.05),见表2。

表2 两组外周血T 细胞亚群及DNT 细胞比较〔M(P25,P75),绝对值/μl〕

2.2 外周血T 细胞及DNT 细胞预测乳腺肿瘤良恶性的诊断 根据ROC 曲线显示,CD3+T 细胞、CD4+T 细胞、CD8+T 细胞及DNT 细胞绝对值预测乳腺肿瘤良恶性的曲线下面积(AUC)均＞0.5,见表3。对于预测乳腺肿瘤良恶性均具有很好的价值,见图1。

图1 外周血T 细胞及DNT 细胞预测乳腺肿瘤良恶性ROC 曲线

表3 外周血T 细胞及DNT 细胞的ROC 曲线

2.3 乳腺癌患者外周血T 细胞及DNT 细胞与临床特征的相关分析 132 例乳腺癌患者样本中,随着肿瘤增大,CD3+T 细胞、DNT 细胞绝对值表达显著降低(P＜0.05);CD4+T 细胞、CD8+T 细胞绝对表达差异不显著(P ＞0.05),但其表达有增加趋势。CD3+T 细胞绝对值在有淋巴结转移组表达显著低于未转移组(P＜0.05);CD3+T 细胞、DNT 细胞绝对值在TNM 不同分期表达显著差异(P＜0.05),见表4。

表4 外周血T 细胞及DNT 细胞绝对值与临床特征相关分析〔M(P25,P75,μl〕

2.4 乳腺癌患者外周血T 细胞及DNT 细胞与分子分型的相关分析 132 例乳腺癌患者LuminalA 型46 例(34.8%),LuminalB 型30 例(22.7%),HER-2阳性型28 例(激素受体阳性10 例)(21.2%),三阴性28 例(21.2%)。CD3+T 绝对值在ER、PR 阳性组的表达显著高于阴性组(P＜0.05);CD4+T 细胞绝对值在HER-2 阳性组的表达低于阴性组,CD8+T 细胞绝对值在HER-2 阳性组的表达显著高于阴性组(P＜0.05);CD4+T 细胞、CD8+T 细胞绝对值在不同分子分型组的表达差异有统计学意义(P＜0.05),见表5。

表5 外周血T 细胞及DNT 细胞绝对值与分子分型的相关分析〔M(P25,P75),μl〕

3 讨 论

正常人体内免疫系统中的免疫细胞处于一个动态平衡状态,当存在免疫抑制和免疫缺陷或严重复合型免疫缺乏症时,其患癌的风险显著增加,揭示了免疫反应在癌症中的重要性〔4〕。外周血T 淋巴细胞亚群作为免疫细胞中的重要组成,不仅参与细胞机体的免疫调节,还参与机体的免疫应答反应,其细胞组成的数量更是反映了免疫现状〔5〕。T 淋巴细胞作为机体发挥免疫作用的重要细胞成分,其表面抗原包括共受体CD3+T、CD4+T(辅助性T 细胞)、CD8+T(细胞毒性T 细胞或杀伤性T 细胞)〔6〕。其中CD3+T 细胞是T 淋巴细胞的典型表面抗原,可反映出T 淋巴细胞的绝对数值,也可综合反映出机体现有的免疫状态水平。在机体遭受创伤、感染、自身免疫功能衰竭及肿瘤的发生发展时,CD3+T 细胞的绝对数值出现异常〔7〕。在乳腺癌患者中,有报道在新辅助化疗后、放疗后、手术后CD3+T 细胞数值出现一定程度减少,可能提示患者的免疫功能下降,相反更高浓度浸润淋巴细胞与更好的预后或与化疗反应相关〔8,9〕。CD8+T 细胞被认为是抗肿瘤的关键组成部分,具有较高水平的CD8+T 细胞的乳腺肿瘤与其有更好的生存期相关〔10,11〕。CD4+T 淋巴细胞作为免疫系统中的中心成员,在招募、激活和调节适应性免疫反应的许多方面发挥关键作用,其辅助功能为B 细胞和CD8+细胞毒性T 细胞介导的反应提供了充分证据。Gu-trantien 等〔12〕研究中,CD4+T 细胞在乳腺癌中不仅是一个至关重要的免疫元件,更是影响乳腺癌患者预后的一个重要因素。有研究显示,如体内缺乏足够的CD4+T 细胞,CD8+T 细胞将无法有效发挥其免疫作用。CD4+T 细胞还通过形成炎症反应特征来不同程度的影响先天免疫。目前研究发现CD4+T 淋巴细胞通过自身细胞毒性溶解人体内病原体的靶细胞,其抗肿瘤作用也可结合MHCⅡ类分子,通过颗粒酶调节或穿孔素的杀伤作用来溶解肿瘤细胞〔13〕。

本研究显示,与乳腺良性肿瘤相比较,CD3+T 细胞、CD4+T 细胞水平均明显减少;CD8+T 细胞的绝对值水平明显升高;CD3+T 细胞及CD4+T 细胞绝对值明显减少直接反映了乳腺癌患者免疫功能低下,与相关文献报道结果相一致〔14,15〕。分析其原因,CD4+T 细胞及CD8+T 细胞作为外周血淋巴细胞的主要亚型处于动态平衡状态,CD4+T 淋巴细胞分泌颗粒酶、穿孔素等细胞因子和激活CD8+T 淋巴细胞通过Fas/Fasl 等方式途径发挥细胞毒素作用〔16〕。当机体肿瘤发生时,其分泌某些大量免疫抑制因子,导致机体的免疫功能及平衡遭到破坏,诱发CD8+T细胞的产生,并反馈性抑制CD4+T 细胞的成熟及产生,从而产生乳腺癌患者外周血中CD4+T 细胞数量的减少及CD8+T 细胞绝对数值的增加,打破了T 淋巴细胞亚群的动态平衡,进而机体的免疫功能紊乱,导致肿瘤进一步发生及发展〔17〕。

目前,判断乳腺癌患者的严重程度及预后的影响因素包括肿瘤大小、是否淋巴结转移、临床分期、组织学分级、病理指标等。肿瘤大小是乳腺癌患者预后的重要指标之一,Zwittex〔18〕在针对T 细胞的研究中指出肿瘤本身在不断发生发展的过程中能产生大量免疫抑制因子抑制T 淋巴细胞产生及成熟,随着肿瘤的逐渐生长,其负荷也不断增大。是否伴有淋巴结转移直接关系到患者治疗方案及预后,To等〔19〕研究显示伴有淋巴结转移的乳腺癌恶性程度更高,其生存期远低于未发生淋巴结转移者,提示肿瘤的免疫逃逸及免疫抑制更为严重。同时随着临床分期的增加,乳腺癌患者机体的免疫功能损伤也更加严重〔20〕。本研究结果表明随着肿瘤增大,CD3+T细胞绝对值明显降低,CD3+T 细胞绝对值在有淋巴结转移组表达明显低于未转移组,CD3+T 细胞绝对值随着分期的增加而降低,与郝华等〔21〕研究结果相符,提出随着肿瘤增大、淋巴结转移及分期的增加,免疫功能明显受到抑制。本研究CD3+T 细胞呈明显下降趋势,同样提示机体的免疫功能遭到严重的抑制及损伤。

乳腺癌是一种与机体激素分泌密切相关的肿瘤,尤其是雌激素与孕激素对乳腺癌患者发生、发展、治疗方案的选择及预后的影响极为重要。本研究表明,CD3+T 绝对值在ER、PR 阳性组的表达均高于阴性组,与相关研究结果相符〔22〕。CD3+T 细胞作为总的外周T 淋巴细胞,对于反映机体抗肿瘤免疫能力也尤为重要,研究也表明非激素受体敏感型的乳腺癌相比较激素受体敏感型的免疫力更加低下,与临床上相比较激素受体阳性的乳腺癌患者,激素受体阴性的乳腺癌患者侵袭能力更强、发展更快、预后较差的结果相吻合。

作为原癌基因,HER-2 是一种具有酪氨酸激酶活性的跨膜受体蛋白,其过表达可促使癌细胞增殖、肿瘤血管及淋巴管产生、增加其侵袭能力及抑制癌细胞凋亡等,使得癌细胞发展迅速,风险相对较高,总生存率较差。韦常宏〔23〕研究发现HER-2 过表达的乳腺癌患者循环血中CD4+T 细胞明显降低,表现出较强侵袭力和较快的发展速度。Muraro 等〔24〕研究发现HER-2 阳性循环CD8+T 细胞数量相对更多,结论证实乳腺癌患者表现出有限的肿瘤相关免疫抑制。Jia 等〔25〕研究发现循环血中高数量CD8+T 细胞的乳腺癌患者HER-2 阳性可能性大。本研究结果说明HER-2 阳性的乳腺癌患者机体免疫功能遭到破坏程度更大,免疫能力也更低下。

Ki-67 是由Gerdes 等〔26〕发现的可作为一种细胞增殖标志物的核蛋白,此核蛋白与乳腺肿瘤的增殖能力息息相关,其表达水平越高,肿瘤的增殖能力越强,发展速度越快。但研究中Ki-67 值与外周血T淋巴细胞无显著相关,其原因可能与纳入研究组例数或病人选择存在偏倚有关,待以后进一步验证。

目前研究普遍表明,分子分型是乳腺癌患者预后的危险因素,与乳腺癌患者的治疗及预后密切相关〔27〕。一般认为,LuminalA、LuminalB 型乳腺癌发展速度慢、侵袭力差、预后相对较好,三阴型乳腺癌则相反。在Gao 等〔28〕的系统评价中,通过收集近些年大量数据,推断CD4+T 细胞及CD8+T 细胞绝对值可以预测三阴型乳腺癌预后,且其水平越低,预后越差,与相关研究结果相一致〔23〕,提示三阴型乳腺癌有相对较强的侵袭力、发展速度快且预后较差。本研究结果提示,外周血CD4+T 及CD8+T 淋巴细胞绝对值与乳腺癌的恶性程度密切相关。

DNT 细胞(CD3+CD4-CD8-T 细胞)是来源仍未明确的免疫细胞,可作为免疫系统对肿瘤激活状态的潜在替代品,且能够反映耐受性和细胞毒性活性的程度,在免疫系统疾病、排斥反应及肿瘤疾病中发挥重要作用。研究发现,DNT 细胞在免疫系统疾病或肿瘤疾病中的数量和功能的下降可能导致效应CD4+T 细胞和细胞毒性CD8+T 细胞的免疫调节丧失,从而破坏机体免疫,导致疾病进一步发展〔29〕。在一些前瞻性研究中,通过裸鼠肿瘤模型均证明DNT 细胞具有杀伤肿瘤的作用:(1)DNT 通过Fas/FasL 通路参与了的抗肿瘤机制〔30〕;(2)DNT 细胞通过分泌细胞因子发挥抗肿瘤作用〔31〕;(3)DNT 细胞通过肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)发挥抗肿瘤作用〔32〕。根据近年来针对DNT 细胞在人体多种肿瘤中的报道表明,DNT 细胞在肺癌、胰腺癌及白血病患者的异种移植模型中具有显著抗癌活性〔33～36〕,且发现输注异种DNT 细胞也不会诱导移植物抗宿主病。针对这一独特特性,支持其作为一种新型抗癌的免疫治疗方法的潜力。Fang 等〔37〕研究通过建立晚期肺癌异种移植模型,发现体外扩增患者及健康供体来源的DNT 细胞显著抑制晚期肺癌异种移植物的生长。Lu 等〔38〕研究中通过分离外周DNT 细胞与胰腺癌Panc-1 共培养,结果表明DNT 细胞抑制人胰腺癌细胞的侵袭和增值。这些研究均体现了DNT 细胞在抗肿瘤免疫治疗的潜在价值。本研究结果提示乳腺癌恶性程度越高,DNT细胞的频率越低,与Strippoli 等〔39〕在寻求黑色素瘤的肿瘤标志物及治疗靶点的研究中发现的结果相一致,DNT 细胞的减少与机体整体反应显著相关。这可能是DNT 细胞与肿瘤相互作用产生的结果,但具体作用机制仍需进一步研究。

目前传统的乳腺癌血清肿瘤标志物有TAP、CEA 及CA15-3,临床上用于筛查和诊断乳腺癌的特异度及敏感度并不是特别理想,本研究明确了CD3+T、CD4+T、CD8+T、DNT 细胞绝对值及DNT 细胞比例在乳腺癌及良性肿瘤患者中存在差异,说明对于乳腺良恶疾病诊断上具有一定价值。本研究结果显示,CD3+T 细胞相比较其他外周血T 细胞亚群的AUC 值最大,提示在预测乳腺肿瘤良恶性诊断价值相对较高。DNT 细胞绝对值及DNT 细胞比例的敏感度较高,CD8+T 细胞特异性较高,对于早期诊断乳腺肿瘤良恶性也具有一定辅助价值。虽结果相比传统血清肿瘤标志物仍较低,但可以加入传统的组合检测模型进一步提高乳腺癌的早期诊断价值,作为一个临床早期诊断恶性肿瘤的有益补充。

综上,外周血CD3+T、CD4+T、CD8+T 及DNT 细胞对于诊断乳腺肿瘤良恶性有参考价值,且与肿瘤大小、淋巴结转移、分期及分子分型有相关性,可辅助临床上乳腺癌早期筛查、诊断及病情分析。