渤海湾海水养殖杜氏盐藻培养条件优化

才金玲，刘 洁，王 雨，张鑫志，邱 琦，关 月

(1 天津科技大学 化学工程与材料科学学院，天津市卤水化学工程与资源生态利用重点实验室，天津 300457；2.天津长芦汉沽盐场有限责任公司，天津 300480)

杜氏盐藻是咸水、沼泽和湿地等环境中普遍存在的浮游植物[1]，由于其特殊生理构造及特性，杜氏盐藻有很宽的环境适宜范围，其可以在从0.5%到约35%的饱和浓度的化学品和盐成分中生活，对温度和pH值的适宜范围比较理想。 在人工控制和胁迫条件下，杜氏盐藻大量积累β-胡萝卜素，大约占到干重的10%～14%。杜氏盐藻已成为用于β-胡萝卜素生物生产的最佳微藻物种之一[2]。近年来，杜氏盐藻的β-胡萝卜素生产能力约为1 200 t/a[3]，预计将满足95%以上的β-胡萝卜素总需求[4]。除此之外，杜氏盐藻在饲料生产[5]、工业[6]及医药[7]应用方面均有着不错的应用潜力。

长期以来，用于商业目的的微藻培养及生产最常见的生产方式是使用室外开放池培养。现有培养基配方中，以海水为溶剂的配方最具发展潜力，尤其对靠近海岸取海水方便的盐藻产业基地极具成本优势，因此针对各地区海水主要成分改良对应的养殖配方可以最大化降低污染风险和降低培养成本。

研究以杜氏盐藻为实验对象，以渤海湾海水为培养溶剂，针对碳源、氮源、磷源、盐度、钙离子和镁离子的种类及含量对该藻种生长及营养物质积累的影响进行实验，并对这六项进行整合，目的是优化出一项更适合盐藻养殖的海水配置的培养基。对盐藻的大规模生产提供科学的理论基础和数据支撑，以实现促进国内盐藻产业的进一步发展的目的。

1 材料与方法

1.1 实验材料

配置培养基所用海水取自天津市滨海新区长芦汉沽盐场有限责任公司，经过滤后使用。

藻种。天津长芦汉沽盐场有限责任公司提供，经纯化后使用。

培养条件。取培养至对数期的藻液为种液，按10%接种量，接种于250 mL锥形瓶中，培养基100 mL，置于培养箱中培养。培养箱培养条件设置为：温度25 ℃，光照强度6 000 lx，光暗比为12 h ∶12 h，每天定时摇瓶3次。

初始培养基。NaNO3425 mg/L，NaH2PO4·2H2O 15.6 mg/L，KCl 74 mg/L，NaHCO3840 mg/L，柠檬酸铁13 mg/L，MgSO4·7H2O 1.23 g/L，CaCl233 mg/L，A5溶液1 mL/L，使用NaCl调整盐度至8.5%。实验所用培养基均用海水进行配置。

1.2 实验方法

1.2.1 海水成分测定

参考国家标准GB/T33584.1-2017，取适量海水，分别使用钙—羧酸和铬黑T为指示剂，用EDTA标准溶液测定海水中的Ca2+和Mg2+含量，使用电感耦合等离子质谱仪测P含量，使用全自动凯氏定氮仪来测定中N含量。

分别使用pH计、盐度计和密度计来测定海水的pH值、盐度和密度。

1.2.2 单因素实验设计

(1)碳源单因素实验。选用未加碳源的初始培养基，以葡萄糖、碳酸氢钠和乙酸钠为三组碳源，设置0.05 mol/L、0.1 mol/L、0.15 mol/L三组浓度，以不加碳源为对照。

(2)氮源单因素实验。选用未加氮源的初始培养基，以硝酸钠、氯化铵和尿素为三组氮源，设置5 mmol/L、10 mmol/L、15 mmol/L三组浓度，以不加氮源为对照。

(3)磷浓度单因素实验。选用未加磷源的初始培养基，以磷酸二氢钠为单一磷源，设置0.05 mmol/L、0.1 mmol/L、0.15 mmol/L、0.2 mmol/L、0.25 mmol/L五组浓度，以不加磷源为对照。

(4)盐度单因素实验。对初始培养基中添加的氯化钠形成的培养基盐度设置四组盐度对比：盐度7%、盐度8%、盐度9%、盐度10%，以不加任何氯化钠的纯海水培养基为对照。

(5)钙离子单因素实验。选用未加任何钙离子的初始培养基，以无水氯化钙为单一钙源，设置0.1 mmol/L、0.2 mmol/L、0.3 mmol/L、0.4 mmol/L、0.5 mmol/L五组浓度，以不加任何钙离子为对照。

(6)镁离子单因素实验。选用未加任何镁离子的初始培养基，以七水硫酸镁为单一镁源，设置1 mmol/L、3 mmol/L、5 mmol/L、7 mmol/L、9 mmol/L五组浓度，以不加任何镁离子为对照。

1.2.3 细胞计数

取1 mL藻液，滴于血球计数板上，在显微镜下进行细胞计数，对每个样品计数三次，取其平均值。

1.2.4 β-胡萝卜素及叶绿素a、b的测定

取3 mL生长至对数期的盐藻藻液，6 000 r/min离心20 min后去掉上清液，加入3 mL 90%的丙酮溶液，震荡破碎后避光保存24 h提取色素，并于分光光度计上读取D450nm、D665nm、D649nm。

根据式(1)换算出藻液中β-胡萝卜素的含量：

(1)

式中：β——β-胡萝卜素的含量，mg/L；V——提取液的体积，mL;f——稀释倍数;2 500——吸光度与β-胡萝卜素的换算系数。

根据式(2)和式(3)计算叶绿素a、b的含量：

叶绿素a含量(mg/L)=13.7D665nm-5.76D649nm

(2)

叶绿素b含量(mg/L)=25.8D649nm-7.6D665nm

(3)

1.2.5 总糖及蛋白质含量

采用苯酚硫酸法检测藻液中的总糖含量，采用考马斯亮蓝法测定藻液中蛋白质的含量。

1.3 显著性数据分析

所有实验在实验时均设置3个平行实验，所得数据使用SPSS中的LSD进行单因素ANOVA方差显著性分析进行分析。以P<0.05为差异显著性的标准，实验结果表示为平均值±标准偏差。

2 结果与讨论

2.1 实验所用海水成分(表1)

表1 实验所用海水成分

表1是通过标准溶液标定法、电感耦合等离子发射光谱法(ICP)、pH计、密度计和盐度计测得的海水中Mg、Ca、P等其他元素的含量以及pH值、盐度和密度的数值。通过表1中数据可以看出实验所测得海水中钙含量为(417.4±20.6) mg/L，镁含量为(1 487.1±36.1) mg/L，钙镁离子含量略高于海南地区及其他地区海水中钙镁离子含量[8-10]，考虑到不同海域中钙镁离子不尽相同，因此该数据虽存在微小差异但在合理范围内；磷含量测得38.28 μg/L，与他人实验数据相同[11]；氮含量测得2 mg/L，略高于许振飞所测得1.27 mg/L～1.71 mg/L[12]，说明海水中含有大量氮，有利于盐藻培养；实验测得pH值与盐度与他人实验数据相似[13-14]；测得取样海水密度(ρs,t,p)为1.02 g/cm3，与苏校平等测得的条件密度(σs,t,p)19 kg/m3～23 kg/m3相似[15]。

2.2 杜氏盐藻光谱扫描结果及最佳测定波长的确定

生长至稳定期的杜氏盐藻的光谱扫描结果见图1。

图1 杜氏盐藻光谱扫描

通过图1可看出，杜氏盐藻在波长680 nm处出现最大光吸收峰，这表明杜氏盐藻的最佳测定波长为680 nm。因此在后续培养实验和絮凝实验中，均选择680 nm为杜氏盐藻最佳测定波长。

2.3 培养条件优化的结果

2.3.1 不同碳源种类及浓度对盐藻生长及营养物质积累的影响

实验测试了三种不同的碳源(碳酸氢钠、葡萄糖和乙酸钠)对杜氏盐藻生长及营养物质积累的影响，以不加任何碳源为空白组对照。

图2 不同碳源种类及浓度对盐藻生长的影响

图3 不同碳源种类及浓度对色素积累的影响

图4 不同碳源种类及浓度对蛋白质积累的影响

图5 不同碳源种类及浓度对总糖积累的影响

乙酸钠对盐藻生长积累虽有促进作用，但不及碳酸氢钠，其中蛋白质积累最高可达17.61 mg/mL±0.77 mg/mL，总糖积累最高可达2.88%±0.20%，但在盐藻的细胞量和色素积累上却起到了抑制作用。同时葡萄糖对盐藻的生长发育也产生了抑制作用，葡萄糖担当唯一碳源时，三种浓度下细胞量、蛋白质和色素的积累量均为测试期间的最低值。推测原因可能是因为葡萄糖在培养期间受氧化生成了葡萄糖酸、葡萄糖二酸或者葡萄糖醛酸等酸性物质，这些物质的积累导致了培养基pH值降低呈酸性，抑制了盐藻的生长发育。

因此碳酸氢钠可以选择作为促进杜氏盐生长及生物质资源积累的最适宜碳源。

2.3.2 不同氮源种类及浓度对盐藻生长及营养物质积累的影响

实验测试了三种不同的氮源(硝酸钠、氯化铵和尿素)对杜氏盐藻生长及营养物质积累的影响，以不加任何氮源为空白组对照。

结果见图6～图9，硝酸钠对杜氏盐藻的生长和营养物质的积累均起到了积极作用，相对比不加氮源的情况下生物量产量显著增加。其中5 mmol/L浓度下的硝酸钠培养基中细胞密度为(2.29±0.25)×106cells/mL，较10 mmol/L和15 mmol/L浓度下碳酸氢钠培养基细胞密度高；5 mmol/L浓度下的硝酸钠培养基中色素含量(叶绿素a、叶绿素b和β-胡萝卜素)分别为4.66 μg/mL±0.42 μg/mL、2.39 μg/mL±0.02 μg/mL和1.78 μg/mL±0.12 μg/mL，较10 mmol/L和15 mmol/L浓度下的硝酸钠培养基中积累的色素含量高；5 mmol/L浓度下硝酸钠培养基中总糖为1.51%±0.03%，较10 mmol/L和15 mmol/L浓度下的硝酸钠培养基总糖含量高。三种氮源培养基中，共同现象每毫升藻液中蛋白质含量与培养基中氮浓度成正比，此现象与宋雨晴等[18]的研究发现相一致，说明高浓度氮有利于盐藻细胞积累蛋白质。

图6 不同氮源种类及浓度对盐藻生长的影响

图7 不同氮源种类及浓度对盐藻色素积累的影响

图8 不同氮源种类及浓度对盐藻蛋白质积累的影响

图9 不同氮源种类及浓度对盐藻总糖积累的影响

综合实验数据分析可知，盐藻在以氯化铵或尿素为氮源时生长发育及生物质资源积累情况均显著低于以硝酸钠为氮源时的生长情况。因此盐藻对尿素和氯化铵这些有机氮源很难有效利用，也证实了尿素的存在确实一定的毒性。因此硝酸钠较之铵态氮更适合作为盐藻培养的氮源。

2.3.3 不同磷浓度对盐藻生长及营养物质积累的影响(图10～图13)

图10 不同磷浓度对盐藻生长的影响

图11 不同磷浓度对盐藻色素积累的影响

由图10～图13可知，盐藻在磷浓度0 mmol/L～25 mmol/L范围内均可正常生长，且在此范围内盐藻生长和营养物质积累情况与培养环境中磷浓度成正比。其中20 mmol/L浓度下的磷酸二氢钠培养基中细胞密度为(3.38±0.25)×106cells/mL，较其他浓度下磷酸二氢钠培养基细胞密度高，生长情况与郁彬琦等[19]所测得盐藻生物量相似；20 mmol/L浓度下磷酸二氢钠培养基中色素含量(叶绿素a、叶绿素b和β-胡萝卜素)分别为15.50 μg/mL±0.10 μg/mL、6.50 μg/mL±0.08 μg/mL和4.91 μg/mL±0.07 μg/mL，较5 mmol/L和15 mmol/L浓度下磷酸二氢钠培养基中积累的色素含量高；20 mmol/L浓度下磷酸二氢钠培养基中蛋白质积累含量为3.72 mg/mL±0.02 mg/mL，较其他浓度下磷酸二氢钠培养基中积累的蛋白质含量高；20 mmol/L浓度下磷酸二氢钠培养基中总糖为1.06%±0. 07%，较其他浓度下磷酸二氢钠培养基总糖含量高。

图12 不同磷浓度对盐藻蛋白质积累的影响

图13 不同磷浓度对盐藻总糖积累的影响

综上所述，20 mmol/L浓度的磷酸二氢钠为杜氏盐藻的最适宜生长磷浓度，其生物量产率，蛋白质、色素和总糖积累量均为最高。

2.3.4 不同盐度对盐藻生长及营养物质积累的影响(图14～图17)

图14 不同盐度对盐藻生长的影响

图15 不同盐度对盐藻色素积累的影响

图16 不同盐度对盐藻蛋白质积累的影响

图17 不同盐度对盐藻总糖积累的影响

实验测试了7%～10%四种不同的盐度对杜氏盐藻生长及营养物质积累的影响，以不加任何氯化钠的纯海水为空白组对照。

盐藻在5%到10%的盐度范围内均可正常生长，从图中可以看出，当盐度为7%和8%时，盐藻细胞密度明显高于空白组，且优势一直保持到稳定期，最高达到了(3.94±0.11)×106cells/mL，较其他盐度下的培养基中细胞密度高，说明在盐度为7%和8%时盐藻可大量且快速生长。同时盐度10%培养基色素积累情况和细胞密度在生长期和稳定期均低于未额外加盐的空白对照组，说明虽然盐藻对盐度适应范围很广，但较高的盐度仍然会抑制盐藻的生长和生物质积累，此现象与张晓钗等[20]发现的高盐环境对藻细胞的胁迫作用相一致。推测原因为盐藻为适应高盐环境会缩小体积且减少运动，从而减少了从环境中汲取及积累营养物质的过程。

综上所述，7%～8%的环境盐度为最适合盐藻培养的盐度，此盐度下杜氏盐藻的细胞密度、色素积累、总糖和蛋白质积累含量可以达到峰值。

2.3.5 不同钙离子浓度对盐藻生长及营养物质积累的影响

实验测试了额外添加0.1 mmol/L～0.5 mmol/L钙离子五种不同的钙离子添加量对杜氏盐藻生长及营养物质积累的影响，以不额外添加任何钙离子的纯海水为空白组对照。

结果见图18～图21，额外添加钙离子量的多少对盐藻生长没有显著的促进作用，相反在不额外添加任何钙离子情况下，盐藻细胞密度最高可达(2.31±0.10)×106cells/mL，高于额外添加了钙离子的五组实验组，且色素、蛋白质和总糖含量积累也无显著性差异。考虑到受测海水中钙离子含量达到了(417.4±20.6) mg/L，额外添加钙离子可能会因为浓度的增加而产生氧化应激，从而扰乱藻类细胞的稳态[21]。

图18 不同钙离子浓度对盐藻生长的影响

图19 不同钙离子浓度对盐藻色素积累的影响

图20 不同钙离子浓度对盐藻蛋白质积累的影响

图21 不同钙离子浓度对盐藻总糖积累的影响

2.3.6 不同镁离子种类及浓度对盐藻生长及营养物质积累的影响

实验测试了额外添加1 mmol/L～9 mmol/L镁离子五种不同的镁离子添加量对杜氏盐藻生长及营养物质积累的影响，以不额外添加任何镁离子的纯海水为空白组对照。

结果见图22～图25，额外添加镁离子量的多少对盐藻生长同样没有显著促进作用，在培养基中额外添加镁离子的情况下，盐藻的细胞密度最高可达(3.21±0. 05)×106cells/mL，此数值接近于不额外添加镁离子的空白处理组的(3.21±0. 09)×106cells/mL，且色素、蛋白质和总糖含量积累也无显著性差异。考虑到受测海水中镁离子含量达到了1 487.1 mg/L±36.1 mg/L，接近于刘建坤[22]所测得最适合杜氏盐藻生长是镁离子浓度7 mmol/L，因此额外添加镁离子可能会抑制盐藻生长。

图22 不同镁离子浓度对盐藻生长的影响

图23 不同镁离子浓度对盐藻色素积累的影响

图24 不同镁离子浓度对盐藻蛋白质积累的影响

图25 不同镁离子浓度对盐藻总糖积累的影响

2.3.7 培养条件优化前后培养效果对比

总结2.3.1～2.3.6六项实验结果，选取最适合杜氏盐藻的最佳单因素并对原培养基进行优化，可得优化后的新培养基，配方见表2。

表2 优化后的培养基配方

根据表2内成分配制培养基，取培养至对数期的藻液为种液，按10%的接种量，接种于250 mL的锥形瓶中，培养基100 mL，置于培养箱中进行培养。培养箱培养条件设置为：温度25 ℃，光照强度6 000 lx，光暗比为12h ∶12h，每天定时摇瓶3次。此为实验组，设置以优化前培养基培养的盐藻为对照组。

结果见图26～图28。

图26 培养基优化前后对盐藻生长的影响

图27 培养基优化前后对盐藻色素积累的影响

图28 培养基优化前后对盐藻蛋白质和总糖积累的影响

实验测试了改良后的培养基对杜氏盐藻生长及营养物质积累的影响，以原培养基为空白组对照。

优化后的培养基对盐藻生长有显著的促进作用，盐藻的细胞密度最高可达(4.00±0.17)×106cells/mL，色素含量(叶绿素a、叶绿素b和β-胡萝卜素)分别达到了18.36 μg/mL±0.66 μg/mL、6.08 μg/mL±0.27 μg/mL和7.80 μg/mL±0.43 μg/mL；蛋白质积累含量达到了2.74 mg/mL±0.16 mg/mL；总糖积累量为2.27%±0.08%，均显著高于优化前培养基的细胞密度及营养物质积累量。

3 结论

文章以杜氏盐藻为实验藻株，对海水养殖杜氏盐藻的培养基进行了优化，并针对优化后的培养基进行了盐藻的培养和营养成分测定，最终的实验结果主要有以下几点：

1)对杜氏盐藻的培养进行单因素实验，针对碳源、氮源、磷源、盐度、钙离子和镁离子的种类及含量对该藻种生长及β-胡萝卜素、蛋白质和总糖等营养物质积累的影响，确定各个因素影响之下的最佳培养条件。根据最佳因素所改良的培养基配方为：NaNO3425 mg/L；NaH2PO4·2H2O 31.2 mg/L；KCl 74 mg/L；NaHCO3840 mg/L；柠檬酸铁13 mg/L；MgSO4·7H2O 0 mg/L；CaCl20 mg/L；A5溶液1 mL/L，使用海水配置，并额外添加NaCl至盐度7%～8%。

2)改良后的培养基对盐藻生长有显著促进作用，盐藻细胞密度最高可达(4.00±0. 17)×106cells/mL，色素含量(叶绿素a、叶绿素b和β-胡萝卜素)分别达到了18.36 μg/mL± 0.66 μg/mL、6.08 μg/mL±0.27 μg/mL和7.80 μg/mL±0.43 μg/mL；蛋白质积累含量达到2.74 mg/mL±0.16 mg/mL；总糖积累量为2.27%±0.08%，均显著高于原培养基的细胞密度及营养物质积累量。