转录因子EB对Erastin诱导铁死亡的影响

马月,陈蕾蕾,谢俊霞

(青岛大学基础医学院生理学与病理生理学系,山东 青岛 266071)

帕金森病(PD)是发病率较高的神经退行性疾病之一，其确切病因尚未完全阐明。研究证实，脑铁代谢异常与α-突触核蛋白的异常聚集在PD发病及进程中起着重要作用，而溶酶体是细胞内重要的储铁细胞器以及降解α-突触核蛋白的主要场所，因此，溶酶体及自噬功能与PD发病密切相关[1-4]。转录因子EB(TFEB)是维持细胞自噬稳定的转录因子[5]。大量PD细胞与动物模型实验均证实TFEB在神经退行性疾病中具有保护作用，提示TFEB可成为治疗或改善PD并提供神经保护作用的有效靶点[6-8]。虽然TFEB在神经退行性疾病中的保护作用研究由来已久，但是以往研究主要侧重于TFEB增强或改善自噬功能、清除α-突触核蛋白等方面，对于TFEB在PD铁死亡中的作用研究目前少见。本实验在PC12细胞上高表达TFEB，并给予铁死亡诱导剂Erastin进行处理，观察光镜下细胞的生长状态并检测铁死亡重要调节因子谷胱甘肽过氧化酶4(GPX4)及铁蛋白轻链(FTL)的表达水平，从铁代谢的角度探究TFEB在对抗铁死亡、保护神经细胞中的可能作用，从而为PD治疗提供新思路。

1 材料和方法

1.1 实验材料

所用PC12细胞购自中国科学院上海细胞库；DMEM培养液、胰蛋白酶购自Hyclone公司；opti-MEM培养液、胎牛血清、马血清、瞬时过表达转染试剂LipofectamineTM3000购自Thermo Fisher公司；PBS缓冲液、青霉素-链霉素混合液购自北京索莱宝科技有限公司；Erastin购自Sigma公司；ECL发光液购自Millipore公司；GPX4抗体和FTL抗体购自abcam公司；TFEB抗体购自Proteintech公司；β-actin抗体购自北京博奥森生物技术有限公司；羊抗兔二抗购自爱必信(上海)生物科技有限公司；空载体质粒与过表达TFEB质粒购自广州锐博生物技术有限公司；BCA蛋白定量试剂盒购自康为世纪公司。

1.2 实验方法

1.2.1实验分组及处理 ①预实验：PC12细胞铺板24 h后分别采用空载体质粒和1、3、5、7 nmol/L浓度的过表达TFEB质粒转染细胞，转染24 h后更换新鲜培养液继续培养，并在光镜下观察细胞生长状态。继续培养24 h(即转染48 h)后收集细胞并提取蛋白，采用免疫印迹法检测TFEB蛋白表达水平，以确定最适转染条件。当采用浓度为5 nmol/L的过表达TFEB质粒转染细胞时，TFEB蛋白表达水平上调最为明显，且光镜下观察细胞生长状态较好，因此选取该浓度作为后续实验中过表达TFEB质粒转染PC12细胞的转染浓度。②细胞转染及药物处理：实验分为空载体组、高表达TFEB组、空载体+Erastin组、高表达TFEB+Erastin组。PC12细胞铺板培养24 h后采用空载体质粒或者5 nmol/L的过表达TFEB质粒转染细胞，转染细胞24 h后，给予或者不给予铁死亡诱导剂Erastin(10 μmol/L)继续处理24 h。

1.2.2光学显微镜观察细胞形态学特征 细胞经药物处理后，在倒置显微镜(OLYMPUS IX73)明场模式下，采用10×10倍的放大倍数观察并获取10个不同视野的图像，随机选取3个视野的图像进行分析，记录细胞形态学特征和该视野中具备细胞形态的细胞数目。

1.2.3免疫印迹法检测FTL和GPX4蛋白表达将药物处理后的细胞用预冷的PBS漂洗1次，去除PBS后按5×105个细胞加50 μL裂解液(RIPA)的比例加入细胞裂解液，使用细胞刮收集各组细胞，置于冰上裂解30 min，在4 ℃下以12 000 r/min离心30 min，收集上清液。用BCA蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度，加入上样缓冲液后100 ℃金属浴5 min使蛋白变性。配制SDS-PAGE凝胶，进行电泳(恒压80 V)、转膜(恒流300 mA，90 min)。转膜结束后将印有蛋白的PVDF膜置于50 g/L脱脂奶粉封闭液中，室温孵育2 h。封闭完成以后洗去封闭液，加入FTL(1∶1 000)、GPX4(1∶10 000)、β-actin(1∶10 000)、TFEB(1∶1 000)一抗，放至4 ℃恒温摇床孵育过夜。去除一抗后用TBST洗膜3次，每次10 min。加山羊抗兔(1∶10 000)的HRP-IgG二抗室温孵育1 h，用TBST洗膜3次，每次10 min。将膜用发光液避光孵育1 min，采用美国UVP凝胶成像系统采集图像。用Image J软件分析条带灰度值，结果以目的蛋白(GPX4、FTL)与内参照蛋白(β-actin)灰度值的比值表示。

1.3 统计学处理

2 结 果

2.1 高表达TFEB对Erastin诱导铁死亡细胞形态学特征的影响

空载体组、高表达TFEB组细胞生长状态良好，呈多角形和梭形，细胞伸展，可见粗大的突起，折光性好。空载体+Erastin组出现轻微细胞毒性与生长抑制现象，细胞数目较少，小部分细胞折光性变差，细胞变圆，突起回缩，表面可见泡状小体，细胞轮廓界限模糊。与空载体+Erastin组细胞相比较，高表达TFEB+Erastin组细胞较为伸展，突起轻微回缩，细胞出现轻微生长抑制现象。

空载体组、高表达TFEB组、空载体+Erastin组、高表达TFEB+Erastin组的细胞数目分别为288.00±29.48、229.30±19.64、89.00±5.00、175.30±2.91(n=3)。与空载体组相比较，空载体+Erastin组细胞损伤明显，存活的细胞数目少；与空载体+Erastin组相比，高表达TFEB+Erastin组细胞生长状态较好，存活的细胞数目多，差异有统计学意义(F=22.2，P<0.05)。

2.2 高表达TFEB对细胞内GPX4及FTL蛋白表达的影响

空载体组与高表达TFEB组细胞内的GPX4蛋白表达水平分别为1.200±0.217、1.667±0.165(n=7)，与空载体组相比，高表达TFEB组细胞内GPX4蛋白表达水平显著上调，差异有统计学意义(t=3.194，P<0.05)。空载体组与高表达TFEB组细胞内FTL蛋白表达水平分别为0.872±0.106、1.631±0.150(n=3)，与空载体组相比较，高表达TFEB组细胞内FTL蛋白表达水平显著上调，差异有统计学意义(t=4.127，P<0.05)。

3 讨 论

近年来，在对PD病因及机制的探索中逐渐证实，除蛋白质异常聚集、线粒体功能障碍、氧化应激、炎症反应等因素与PD发病密切相关外，黑质区铁异常沉积这一病理改变也参与PD的发生发展[9-13]。铁是维持生物体基本生理功能的重要元素，随着年龄增加，铁会在脑中聚集，而这种聚集会在神经退行性疾病尤其是PD中加剧[14-15]。在PD中，过量的铁会形成羟自由基，进而诱导氧化应激，增强多巴胺衍生的代谢毒性，并通过促进α-突触核蛋白表达和聚集而加剧多巴胺能神经元退变[16-18]。铁死亡是一种依赖于铁的非凋亡性的细胞死亡方式，在1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶(MPTP)诱导的PD小鼠模型和过表达α-突触核蛋白的转基因小鼠模型中均发现了铁死亡现象，而且铁死亡抑制剂ferrostatin-1可以显著抑制鱼藤酮对多巴胺能神经元的毒性[19-20]。这些研究均提示，铁死亡参与了PD多巴胺能神经元退变过程，抑制铁死亡很有可能成为保护多巴胺能神经元、干预PD的有效策略之一。

虽然TFEB在PD中的保护作用已被大量研究证实，但是以往的研究主要侧重于TFEB激活或改善自噬功能、清除α-突触核蛋白方面，对于TFEB在PD铁死亡中的作用研究较少。最近有文献报道，羧基修饰的聚苯乙烯纳米颗粒可以通过促进TFEB核转位、增强细胞内超氧化物歧化酶表达、降低活性氧水平、抑制脂质过氧化来抑制铁死亡[21]。然而，TFEB是否还可以通过其他途径抑制铁死亡，以及其与PD中铁死亡发生的关系目前尚不清楚。

铁死亡的标志蛋白GPX4是一种内源性的膜脂修复酶，在其催化下，谷胱甘肽可将具有潜在毒性的过氧化脂类还原为无毒的脂醇，从而阻止铁死亡的发生，而当铁死亡发生时GPX4的表达降低[22]。PC12细胞来源于大鼠肾上腺髓质的嗜铬细胞瘤，当神经生长因子(NGF)存在时，可以分化为交感神经元[23-24]。PC12细胞可以合成和储存多巴胺，因此也被广泛用作神经退行性疾病的细胞模型[25]。本实验中，当在PC12细胞上高表达TFEB时，GPX4蛋白表达水平明显上调，从功能的角度直接验证了TFEB对抗铁死亡、保护细胞的作用。Erastin是一种常用的铁死亡诱导剂[26]，本实验中给予Erastin(10 μmol/L)处理细胞24 h，并通过光学显微镜观察各组细胞的生长状态。本文研究结果表明，高表达TFEB可降低Erastin诱导的细胞毒性，保护细胞免受铁死亡的影响。另一方面，铁死亡发生时会诱导铁自噬，即铁蛋白的降解，从而释放铁、增加细胞内不稳定铁池，进而增加细胞氧化水平[27]。铁蛋白是机体用来储存铁的主要蛋白质。铁蛋白由FTL和铁蛋白重链(FTH)组成，其中，FTH具有亚铁氧化酶的活性，负责铁的吸收，而FTL负责铁的储存。铁蛋白的降解会导致铁的释放从而导致氧化损伤[28]，抑制铁蛋白降解可以抑制Erastin诱导的铁沉积、脂质过氧化以及铁死亡发生[29]。本文实验结果表明，PC12细胞高表达TFEB后，FTL水平明显升高，提示高表达TFEB可以增强细胞储铁能力，从而降低胞浆内游离的氧化还原活性铁，减少氧化应激，从这一角度也可证实TFEB对铁死亡的抑制作用。

综上所述，在PC12细胞上高表达TFEB，可降低铁死亡诱导剂Erastin的毒性作用。同时，高表达TFEB可上调FTL与GPX4蛋白表达水平，提示TFEB可能通过增加细胞铁储存、降低细胞内游离铁水平，抑制铁死亡，保护神经细胞。本实验初步从铁代谢的角度探讨了TFEB的神经保护作用，为防治PD提供了新思路。然而，TFEB是通过何种途径调节铁代谢，以及通过何种途径抑制铁死亡、保护神经元目前尚未可知，仍需进一步研究探讨其具体作用机制。