脱细胞基质在软骨及骨组织工程中的应用研究进展

田臻,林科夫,黄奇,高峰,万莎,李浪

(西藏自治区人民政府驻成都办事处医院,四川 成都 610041)

组织工程技术能够通过再生修复重建受损组织的结构和功能，因此得到广泛关注与研究。而通过组织工程技术实现此过程的前提是适合的支架材料。脱细胞基质(AM)是指经特殊处理以除去组织中细胞成分，制备成无活体细胞存在的细胞外基质(ECM)成分和结构的生物支架。此支架具有优良的生物相容性，保留了生物活性且无免疫排斥反应，被越来越多地应用到组织工程中[1]。至今AM已被应用于多种组织和器官的临床重建，如软骨、膀胱[2]和心脏[3]等。本文就脱细胞软骨基质(ACM)的概述、制作技术、支架力学性能以及在软骨与骨组织工程中的应用进行综述。

1 ACM的概述

脱细胞的生物基质材料被认为是一类极具前景的生物材料，这些经过脱细胞处理的基质含有部分的天然ECM成分和结构，为细胞的黏附、生长和增殖提供了良好的微环境；此外，ACM植入体内后很容易被降解和吸收[4]。目前有许多脱细胞的基质材料用于组织工程研究中，部分已用于临床，并取得了较好的临床效果。例如：皮肤、心包、血管、膀胱等AM[5]。

软骨基质由于其自身的结构特殊性及免疫原性，目前还没有被批准用于临床，有学者按其来源将软骨基质分为两类[6]：①天然软骨基质，如关节软骨、耳软骨、鼻软骨等；②软骨细胞分泌的ECM，这些基质可能缺乏某些天然基质的成分，其密度多低于天然组织。天然软骨基质用于软骨组织工程具有以下优点：①软骨来源广泛、获取方便，重塑能力良好，异种及异体皆可；②其成分更接近待修复的软骨组织，具有良好的生物相容性[7]。基于以上优点使得天然软骨基质成为目前软骨组织工程的一大研究热点，同时软骨基质具有潜在的临床应用可能性。

2 ACM的制作技术进展

天然软骨内的软骨细胞是免疫抗原的主要成分，因此脱去软骨细胞及其相关的DNA等物质是获得支架材料的重点。但天然软骨结构致密，直接脱细胞效果不佳，目前常采用的脱细胞方法有：①物理方法[8]，用液氮反复冻融导致细胞内形成冰晶，破坏细胞膜和细胞核，但不能完全消除细胞DNA，DNA的残留可能引发强烈的免疫原性反应；②脱细胞化处理，一般采用物理和化学相结合的方法去除基质内所有细胞及其组分如DNA和RNA[9]。软骨脱细胞可采用软骨片和软骨微粒两种形态：①软骨片方式，将软骨片经反复冻融后产生裂隙，加入化学试剂，试剂通过裂隙达到脱细胞的目的，但该方法脱细胞的效果有待进一步考证[10]；②软骨微粒方式，较常用的方法是将软骨片经反复冻融、冷冻硬化后再研磨成软骨微粒，从而破坏软骨的天然大分子结构，有效暴露软骨基质，再使用化学试剂破坏细胞并将其清除，该方法脱细胞较彻底，但由于软骨结构的破坏，大大降低了软骨基质的机械强度。因此，寻求脱细胞效果和维持机械强度之间的平衡是制作ACM的研究方向。

目前常用的脱细胞化学试剂包括：三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐(Tris-HCl)、乙二胺四乙酸(EDTA)、聚乙二醇衍生物(Triton X-100)、十二烷基硫酸钠(SDS)和月桂基硫酸钠(SLS)。SDS和SLS能破坏蛋白之间的连接从而去除细胞[11]；Tris-HCl作为核酸和蛋白质的溶剂，可以溶解软骨片的血污及油污[12]；Triton X-100是一种非离子洗涤剂，可破坏DNA蛋白、脂质和脂质蛋白相互作用[13]；EDTA用作洗涤剂、血液抗凝剂[14]。常用的脱细胞酶包括核酸酶和胰蛋白酶，特别是DNaseⅠ，可以消除分散的核碎片，减少DNA；胰蛋白酶能破坏胶原纤维周围的ECM，产生微小的通道，并促进随后脱细胞剂的渗透[15]。目前国内外文献中已介绍了多种脱细胞方法，大部分都是以上各个试剂的组合及拓展。

YANG等[9]报道了一种软骨去细胞化的方法，首先将软骨切片浸入液氮中，冷冻干燥后，将样品研磨成粉末，然后用胰蛋白酶和核酸酶处理软骨粉，再用Triton X-100去细胞化，从而获得脱细胞的软骨基质。但是，研磨导致了软骨的天然结构破坏，ECM没得到较好地保存。后来BENDERS等[16]改进了该方法，他们将软骨片在液氮中快速冷冻，在37 ℃下进行 6 次胰蛋白酶-EDTA处理，核酸酶溶液处理后放入Triton X-100中浸泡从而获得脱细胞支架，该支架保留了大多数的Ⅱ型胶原，可以促进间充质干细胞(MSCs)的软骨分化。然而，定量二甲基亚甲基蓝(DMMB)分析结果显示，胰蛋白酶处理后的支架会丢失大量糖胺聚糖(GAG)。TAVASSOLI等[17]将物理方法和化学方法结合，组织先在 -4 ℃保存1周，在液氮中进行 5 次冻融循环，最后用25 g/L的 SDS 处理1、4 和 8 h，这种方法保存了大量的GAG和胶原。 另外，有学者调节部分脱细胞试剂后显示能够保留更好的ACM支架的力学性能[18]。ZHANG等[19]将软骨片用10 mmol/L含有苯基磺酰氟的Tris-HCl浸泡24 h，然后在含体积分数0.01的 Triton X-100 的 Tris-HCl中浸泡 48 h，最后用2 000 U/L的 DNAse化盐水溶液处理 12 h，以去除DNA残留，该脱细胞过程去除了 90% 的DNA，但保留了82.4%的CAG和 82.8% 的胶原。

多项研究提出可用去污剂-酶法去除细胞[20-21]，该方法运用去污剂-酶法结合传统的物理方法如冻干、照射法，脱去软骨基质中的细胞成分(如DNA、RNA等)，保留ECM材料(如弹性蛋白、胶原等)。通过多次使用去污剂及酶对细胞成分进行处理，将其脱出或破坏，从而达到充分去除软骨细胞表面的组织相容性抗原[22]。

但是前文提及的所有试剂均有毒性，因此脱细胞后还需要长时间的浸泡以去除残留在支架内的毒性试剂[23]。另外，反复的脱细胞操作后软骨基质的主要成分Ⅱ型胶原和GAG含量会下降，基质的生物力学性能也有不同程度的降低。因此，如何将ACM改性，提高其力学性能从而进一步应用于负重组织的修复[24]，是目前软骨组织工程研究的另一个热点。

3 ACM支架力学性能的增强方式

目前提高支架力学性能的方法有两种[25]：第1种是寻求更有效的交联方法；第2种是结合其他的材料的特性，与ACM优势互补，从而达到改性的目的。

有研究者采用二氧化碳激光技术对猪的脱细胞关节软骨基质支架(CMS)表面进行改性，通过优化激光参数，在软骨支架表面引入了大小适宜、呈晶格状排列的锥形微孔。研究结果显示，激光修饰的 CMS可以提高脱细胞支架的杨氏模量，有利于细胞黏附[26]。VISSER等[27]用甲基丙烯酰胺与脱软骨细胞基质水凝胶进行光反应成胶，研究结果显示，压缩弹性模量为 70 kPa。GARRIGUES等[28]为加强支架的纳米级结构，采用静电纺丝技术制备单层及多层的电纺聚ε-己内酯(PCL)-ACM支架，多层PCL-ACM支架的孔径最小为(0.90±0.15) mm，但压缩弹性模量仅为10 kPa。

PINHEIRO等[29]分别用4种交联剂(分别是京尼平、戊二醛、葡萄籽原花青素和没食子酸)对ACM进行化学交联，结果发现只有京尼平、戊二醛交联后的支架材料的孔径没有明显改变，其中戊二醛几乎对支架的孔径没有影响，他们认为戊二醛可以作为一种有效的ACM交联剂，可以替代其他的交联剂。WANG等[30]利用“液相共合成”技术，将矿化关节软骨ACM和纳米相(HAP)脱细胞软骨ECM(ACECM-HAP)悬浮液、纯ACECM悬浮液分别制备集成双层支架。结果显示，支架孔径从(21.2±3.1)到(128.2±20.3) μm不等。随着HAP的比例加大，复合材料的力学性能逐渐增强，当HAP/ACECM比值为70 g/L时复合材料最接近天然的钙化软骨。BECK 等[31]在ACM水凝胶中加入甲基丙烯酸酯，并用紫外线进行交联获得甲基丙烯酸可溶性脱细胞软骨凝胶(MESDCC)，MESDCC支架力学性能良好，弹性模量高达(1 070±150) kPa，完全达到正常软骨的要求。

GONG等[32]应用世界上最薄的材料氧化石墨烯(GO)对3D-ACM进行修饰改性(GO能够改善支架的内部结构，提高支架的机械强度)，修饰后的复合支架在体外可促进细胞黏附、细胞增殖和软骨分化，并且复合支架具有良好的生物相容性。实验结果表明，GO修饰的3D-ACM复合支架可以满足软骨修复支架的力学和生物学要求，这项研究能为软骨组织工程和临床转化的研究提供参考。

因此，寻求一种化学和物理的混合交联的方法可能是提高ACM支架力学性能的一个研究方向。

4 ACM在软骨及骨组织工程中的应用

ACM的某些成分接近天然软骨，如葡萄糖胺聚糖、胶原蛋白等，将其用在软骨组织工程中具有得天独厚的优势[33]。国内外不少的科研团体对此做过一些探索，主要集中在两个方面。①将ACM制作成可注射悬浆，用于骨关节炎模型或骨缺损模型的修复。张亚鑫[34]制备了脱细胞软骨基质颗粒，体外实验及电镜观察证实其具有良好的生物学特性及力学结构，将含该颗粒的悬浆注射入新西兰兔的膝关节，修复膝骨关节炎模型，结果发现负重区软骨侵蚀明显减少，磨损区有透明样软骨生成。②将ACM制作成三维支架，植入体内修复临界软骨缺损[35]。吴军成等[36]用脱细胞耳软骨(DC)与磷酸三钙人工骨(β-TCP)制作成圆柱状的β-TCP-DC生物复合支架，支架负载经骨髓间充质干细胞(BMSCs)诱导成的软骨细胞，同时加入转化生长因子-β、胰岛素样生长因子1修复兔的关节软骨缺损，20周后实验组缺损内透明软骨生长，与周围正常软骨连接良好。LI等[29]用兔软骨细胞接种CMS，体外培养8周后在支架的表面及微孔内发现软骨样组织，而植入裸鼠体内的支架也发现了乳白色软骨组织，修复兔的膝关节缺损结果满意。因此，激光加工微孔后的脱细胞异种CMS是一种可用于关节软骨的修复的支架。PARK等[37]用3周龄的猪软骨经过处理后制作成ACM膜，将提取的新西兰兔关节软骨细胞种植在膜上，发现细胞的活力和增殖量与在标准培养皿上培养的相似；另外将2×105、4×105和6×105/cm2等3个密度的软骨细胞种植在膜上，显示ACM膜可以承受不同密度的细胞生长；复合细胞的材料种植在裸鼠皮下4周即发现了新生软骨，下一步他们将应用于软骨缺损的修复。ZHANG等[38]提取人脐带沃顿果冻间充质干细胞(hWJMSCs)，将hWJMSCs接种于ACECM导向支架中，构建细胞支架复合物，用于修复6只山羊股骨髁关节软骨的全层缺损。实验分为细胞支架复合物组(实验组)和微骨折组(空白组)，结果显示，2周和4周时两组的免疫炎症参数比较无明显差异，MRI显示实验组具有更好的透明软骨再生，组织学评估显示实验组的软骨缺损处Ⅱ型胶原含量更高。

ACM还有不少应用于骨软骨修复方面探索。WANG等[30]将兔的软骨细胞接种在支架表面后发现，细胞呈低渗透性、仅停留在材料的表层，提示支架具有较高的细胞性和丰富的基质沉积，可以作为一种骨软骨修复的候选材料。ZHANG等[19]取兔的膝关节股骨髁软骨在脱细胞后制备脱细胞骨软骨基质片，取P3代的脂肪干细胞接种在材料上修复兔的膝关节股骨髁软骨缺损，组织学结果显示细胞材料组具有更好的界面整合、软骨再生和胶原纤维排列，类似于天然结构，且再生和整合区的GAG和胶原积累显著增加；基因表达分析表明，ACM软骨片形成的相关软骨mRNA表达水平显著升高，与组织学结果一致。ACM由于保留了大部分软骨基质的成分，该研究也利用3D-ACM分别复合人尿源性干细胞(hUSCs)和hBMSCs修复软骨缺损，结果显示都能有效地修复软骨，两种细胞没有明显的统计学差异。

5 小结与展望

ACM是一类极具应用前景的生物材料，如今软骨组织工程对ACM的制备及改性研究已经取得了长足进步，为软骨缺损的修复提供了新的方式。但是由于软骨的特殊结构，使用组织工程技术修复软骨仍然面临巨大的挑战，这些新的软骨修复措施都需要采用稳健的方法进行临床试验，以评估它们在临床应用中的疗效和安全性[39]。因此，对材料的改性以增强其力学性能仍然是今后的重点研究方向。相信未来ACM可以成为一种成熟的临床广泛应用的组织材料。