去铁胺对脂多糖诱导小鼠黑质多巴胺能神经元损伤的影响

李映慧,谢俊霞,王俊,

(1 青岛大学医学部基础医学院生理学教研室,山东 青岛 266071； 2 青岛大学脑科学与疾病研究院)

帕金森病(PD)是一种进展缓慢的神经退行性疾病，其发病机制迄今尚不明确，许多研究表明慢性炎症参与了PD的发病[1-2]。脂多糖(LPS)作为一种炎症源，已被证明是实验动物黑质纹状体多巴胺能神经元死亡的有效引发剂[3]。C57BL/6小鼠黑质、纹状体、侧脑室内注射LPS均可以诱导黑质酪氨酸羟化酶(TH)阳性的多巴胺能神经元脱失、运动行为改变和纹状体多巴胺减少[4]。有研究表明，黑质中铁的异常沉积在PD的发病中起着关键作用[5-6]。过量的铁可以通过Fenton反应促进羟自由基的生成，造成细胞损伤。LPS在小鼠模型中引发的神经元损伤，与脑铁积累和一系列炎症级联反应有关[7]。本实验通过黑质注射LPS及铁螯合剂去铁胺(DFO)，采用免疫组织化学方法检测黑质中TH阳性多巴胺能神经元的数量，探讨DFO对LPS诱导的多巴胺能神经元损伤是否具有保护作用。

1 材料与方法

1.1 实验动物及试剂

SPF级雄性C57BL/6小鼠40只，8周龄，体质量(20±2)g，购于北京维通利华实验动物有限公司。小鼠单笼饲养于有适量食物和水的洁净动物房内，可以自由饮食。动物房室温(20±2)℃，湿度(50±2)%，12/12 h昼夜循环光照。小鼠适应性饲养1周进行后续实验。动物使用和管理经青岛大学动物伦理委员会批准。主要试剂：LPS、DFO购于美国Sigma公司，TH兔抗多克隆抗体购于英国Abcam公司，其余试剂均从当地试剂公司购买。

1.2 动物分组与处理

将40只实验小鼠随机分为对照组、LPS组、DFO组和LPS+DFO组，每组10只。小鼠用异戊烷麻醉后固定在脑立体定位仪上，调整耳杆使小鼠头部位于同一平面。碘附消毒后剪开小鼠颅脑背侧皮肤，用体积分数0.03的过氧化氢溶液擦拭颅骨表面至颅缝和前后囟清晰可见。黑质定位坐标：前囟后3.1 mm，左右旁开1.5 mm，深度4.1 mm。通过显微注射针以0.2 μL/min的流量注射完毕后留针10 min。对照组注射生理盐水1 μL，LPS组注射1 mg/L的LPS 1 μL，DFO组注射50 mmol/L的DFO 1 μL，DFO+LPS组注射1 mg/L LPS和50 mmol/L DFO的混合液1 μL，继续喂养7 d进行后续检测[8]。

1.3 TH阳性神经元检测

采用免疫组织化学法检测TH阳性神经元的数量。小鼠灌注取脑，制备20 μm厚切片，每只小鼠留脑片4张。脑片以40 g/L多聚甲醛溶液固定10 min，应用0.01 mol/L PBS溶液洗3次(每次10 min)，山羊血清封闭2 h，加TH一抗孵育过夜；用0.01 mol/L PBS 溶液洗3次(每次10 min)，加二抗孵育；以0.01 mol/L PBS溶液洗3次(每次10 min)，DAB显色，中性树胶封片。在20倍物镜下计数每张脑片黑质区阳性神经元，将每张脑片中的阳性神经元总数再乘以 4，即得到黑质区 TH阳性神经元总数。

1.4 统计学处理

2 结 果

对照组、DFO组、LPS组和LPS+DFO组黑质区TH阳性神经元总数分别为(14.75±1.75)×103、(12.14±2.32)×103、(5.26±1.42)×103和(11.14±1.18)×103(n=6)。析因设计的方差分析显示，DFO和LPS两种因素存在交互作用(F=36.40，P<0.05)。主效应分析显示，LPS组与对照组相比，TH阳性神经元总数明显降低，差异有统计学意义(F=55.58，P<0.05)；DFO组与对照组相比，TH阳性神经元总数降低，差异亦有统计学意义(F=5.58，P<0.05)。单独效应分析显示，DFO组与对照组相比，TH阳性神经元总数差异无显著性(F=4.84，P=0.05)；LPS组与对照组相比较，TH阳性神经元总数差异有统计学意义(F=106.15，P<0.05)；LPS+DFO组与LPS组相比较，TH阳性神经元总数差异有统计学意义(F=60.74，P<0.05)；而LPS+DFO组与DFO组相比，TH阳性神经元总数差异无显著性(F=0.88，P=0.37)。

3 讨 论

PD作为仅次于阿尔茨海默病的第二大神经退行性疾病，其主要病理特征是中脑黑质多巴胺能神经元的进行性丧失和纹状体多巴胺耗竭[8]，与小胶质细胞诱导的神经炎症、氧化应激及线粒体功能障碍密切相关[9-10]。大量研究结果表明，神经炎症在PD的发病过程中起着关键作用，源自非神经元细胞(包括小胶质细胞)的炎症递质，如活性氧(ROS)、一氧化氮、肿瘤坏死因子α(TNF-α)和白细胞介素1β(IL-1β)均可以调节PD中神经元细胞死亡的进程[11-13]。纹状体内注射LPS可激活小胶质细胞，引起炎症反应，导致羟自由基的产生及细胞外多巴胺、谷氨酸和腺苷水平上升，并引发多巴胺能神经元损伤反应[14]。

铁作为中枢神经系统生长及发育所必需的微量元素，在正常衰老和神经退行性疾病的许多生物过程中起着重要作用，不仅参与调节线粒体产生能量，还与中枢神经系统的正常髓鞘形成密切相关[15]。大量研究显示，PD病人存在铁代谢异常，病人脑中铁逐渐积累，特别是在黑质致密部[16-17]。铁介导的多巴胺能神经元损伤与其参与ROS的生成有关，过氧化氢在多巴胺氧化脱氨基过程中产生，它与Fe2+反应，产生羟基自由基，破坏蛋白质、核酸和膜磷脂等，进而引起多巴胺能神经元损伤[18]。

铁螯合剂作为PD的潜在治疗药物，通过降低不稳定的铁的水平来预防和治疗模型小鼠PD[15]。DFO可以螯合过多的三价铁，清除过量游离铁，抑制羟自由基生成，从而抑制氧化应激反应，起到保护多巴胺能神经元的作用。有研究证实，DFO预处理可以改善LPS诱导的小胶质细胞激活和降低海马中升高的IL-1β和TNF-α水平，阻止LPS诱导的海马中丙二醛和超氧化物歧化酶水平的增加，并降低其诱导的铁积累[7]。本实验室前期研究证实，神经炎症会激活小胶质细胞，通过白细胞介素6信号，刺激星形胶质细胞释放铁调素，向神经元发送信号，调节神经元铁代谢相关蛋白的表达，导致神经元铁的沉积，进而引起神经元损伤[19-21]。本实验结果显示，与LPS组相比，DFO联合LPS处理组黑质TH阳性多巴胺能神经元数量明显增多，这可能与DFO螯合铁从而降低ROS水平有关。

总之，本实验结果表明，铁螯合剂DFO具有防止LPS诱导的多巴胺能神经元死亡的神经保护作用。在此基础上，我们将继续探索其相关机制，为对抗神经炎症的生物学效应开辟一条新的途径，也为PD的治疗提供新的实验和理论基础。