结直肠癌组织NDRG4基因启动子甲基化状态观察及其诊断效能分析

马晓阳，江泽友

1自贡市第四人民医院检验科，四川自贡 643000；2成都中医药大学医学技术学院；3成都中医药大学附属医院检验科

随着社会经济快速发展、人口老龄化、居民生活方式及饮食结构的改变，我国结直肠癌发病率及病死率逐年上升，并呈现年轻化趋势［1］。研究显示，晚期结直肠癌患者的5年生存率不足10%，而早期患者可达90%以上［2］。随着基因组学和表观遗传学的深入发展，基因启动子甲基化与肿瘤发生发展的关系成为研究的热点［3］。基因启动子甲基化是指DNA甲基转移酶将甲基基团转移到DNA上，以CpG二核苷酸中胞嘧啶第5位碳原子上最常见，形成5-甲基胞嘧啶［4］。DNA甲基化在基因表达调控中具有关键作用，涉及细胞中的多个生理过程，如基因沉默、基因印迹、X染色体失活以及细胞类型特异性表达程序的建立和维持［5］。在人类基因组中，大约80%的CpG二核苷酸是甲基化的，而20%未甲基化的CpG二核苷酸常位于基因启动子。甲基化的DNA具有更好的稳定性，可以通过调节基因转录和染色体构型导致基因低表达或不表达［6-7］。DNA启动子异常甲基化在肿瘤中普遍存在，是肿瘤发生过程中最早的变化之一。N-Myc下游调节基因4（NDRG4）可编码一种细胞质蛋白，广泛表达于从线虫到人类的真核生物细胞中，其在结直肠癌组织中的表达明显降低，但是目前关于NDRG4基因启动子甲基化与结直肠癌的关系研究较少。本研究观察了结直肠癌组织NDRG4基因启动子的甲基化状态，并分析其与患者临床病理参数的关系，为结直肠癌的早期诊断提供新的理论依据。

1 资料与方法

1.1 临床资料选择2014年1月—2016年12月成都中医药大学附属医院收集的结直肠癌石蜡组织43例份，均经病理确诊，术前均未行放化疗及免疫治疗；另选对应的癌旁石蜡组织24例份作为对照组。43例原发性结直肠癌患者中男22例、女21例，年龄≤60岁23例、>60岁20例，肿瘤生长部位：直肠23例、结肠20例，分化程度：高分化16例、中分化19例、低分化8例，肿瘤浸润深度：T1期1例、T2期14例、T3期23例、T4期5例，淋巴结转移阳性15例，临床分期：Ⅰ期15例、Ⅱ期15例、Ⅲ期13例。本研究通过医院伦理委员会审核，患者均签署知情同意书。

1.2 NDRG4基因启动子甲基化检测采用定量甲基化特异性PCR（qMSP）法。

1.2.1 基因组DNA提取选择经HE染色证实存在癌组织并占60%以上的蜡块，切取5～8张10 μm厚组织，装入1.5 mL离心管。按照石蜡包埋组织DNA快速提取试剂盒说明书提取组织DNA，以50 μL洗脱液洗脱DNA。使用微量紫外—可见光分光光度计测定所提取的DNA浓度。

1.2.2 亚硫酸盐转化严格按照DNA甲基化转换试剂盒说明书对样品DNA进行亚硫酸盐转换及纯化，经亚硫酸盐处理后DNA中非甲基化的胞嘧啶转换为尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不能发生该反应。最后使用20 μL洗脱缓冲液进行洗脱。

1.2.3 定量甲基化特异性PCR反应在UCSC数据库（http：//genome.ucsc.edu）中下载NDRG4基因启动子序列，应用甲基化分析网站MethPrimer（http：//www.urogene.org/methprimer）在 线 分 析NDRG4基因启动子CpG岛，并下载亚硫酸盐转换后的DNA序列，结果显示在NDRG4基因启动子共检测到两个CpG岛。CpG岛1位于-461～-351 bp，共111 bp；CpG岛2位 于-348～+175 bp，共523 bp。qMSP产物长度157 bp，正向引物设计位于-31～-9 bp，共覆盖3个CpG位点；反向引物位于+106～+126 bp，共覆盖3个CpG位点；荧光探针位于+4～+29 bp，共覆盖5个CpG位点。扩增区域位于CpG岛2的转录起始位点附近。针对亚硫酸盐转换后的序列设计特异性引物探针，引物探针由上海生工生物工程有限公司设计合成，见表1。采用双重PCR扩增技术，同时扩增NDRG4和内参ACTB基因。qMSP反应体系：DNA模板（亚硫酸盐转换后）2 μL，1×Su⁃per Real Pre Mix，正反向引物0.2 μmol/L，Taqman探针0.15 μmol/L，ddH2O补齐至20 μL。PCR扩增循环参数：95℃预变性15 min，95℃变性3 s，60℃退火/延伸20 s，共45个循环。

表1 NDRG4和内参ACTB基因的引物及探针序列、产物长度

1.2.4 甲基化判定标准当基因相对位点CpG发生甲基化则可检测到荧光信号的增加，且荧光信号产生的阈值循环数（Ct）与甲基化基因的数量相关。根据临床对于检测敏感性和特异性的需求分析，判定NDRG4基因启动子甲基化的Ct值截断值为40，且只有当内参基因的Ct值≤36，结果才有效［8-9］。甲基化判定标准：①ACTB基因的Ct值≤36，甲基化NDRG4基因Ct值≤40时判定为发生甲基化；②ACTB基因Ct值≤36，甲基化NDRG4基因Ct值>40时判定为未发生甲基化；③ACTB基因Ct值>36或者无Ct值时，判定为无效，不纳入统计。以发生甲基化的标本数占总标本数的百分比计算NDRG4基因启动子甲基化率，并比较不同临床病理参数结直肠癌患者的NDRG4基因启动子甲基化率。

1.3 统计学方法采用SPSS23.0统计软件。计数资料以n（%）表示，结果比较采用χ2检验或Fisher确切概率法。绘制NDRG4基因启动子甲基化诊断结直肠癌的受试者工作特征（ROC）曲线，计算曲线下面积（AUC）及敏感性、特异性。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 结直肠癌组织和癌旁组织NDRG4基因启动子甲基化率比较结直肠癌组织和癌旁组织NDRG4基因启动子甲基化率分别为65.12%（28/43）和4.17%（1/24），P<0.01。

2.2 不同临床病理参数的结直肠癌患者癌组织NDRG4基因启动子甲基化率比较不同性别、年龄、肿瘤生长部位、组织分化程度、肿瘤浸润深度、淋巴结转移及TNM分期的结直肠癌患者癌组织NDRG4基因启动子甲基化率比较均无统计学差异（P均>0.05）。见表2。

表2 不同临床病理参数的结直肠癌患者癌组织NDRG4基因启动子甲基化率比较［例（%）］

2.3 NDRG4基因启动子甲基化对结直肠癌的诊断效能ROC曲线结果显示，NDRG4基因启动子甲基化诊断结直肠癌的AUC为0.823 2（95%CI：0.725 5～0.920 8，P<0.01），敏感度为65.12%（95%CI：49.01～78.54），特异度为95.83%（95%CI：76.88～99.78）。见图1。

图1 NDRG4基因启动子甲基化诊断结直肠癌的ROC曲线

3 讨论

既往研究多认为恶性肿瘤是由于细胞内遗传学改变所导致的，近年来越来越多的证据表明表观遗传学改变与细胞内遗传学改变共同作用是细胞发生癌变的重要原因［5］。常见的表观遗传学改变包括DNA甲基化、组蛋白修饰、染色质重塑以及非编码RNA调控，其中DNA甲基化是哺乳动物中研究最广泛和最常见的表观遗传学改变［10］。研究表明，正常细胞中抑癌基因启动子CpG岛通常处于未甲基化状态，而肿瘤细胞中则处于高度甲基化状态［11］。NDRG4基因位于染色体16q21，有24个外显子，其编码的蛋白在星形胶质细胞的生存和细胞周期中发挥重要作用，同时也参与调控血管平滑肌细胞的有丝分裂。本研究对NDRG4基因进行分析，结果发现该基因启动子富含大量的CpG位点，并检索到两个CpG岛，CpG岛1位于-461～-351 bp，共111 bp；CpG岛2位于-348～+175 bp，共523 bp。目前，多项研究显示NDRG4基因启动子CpG岛在胰腺导管癌、乳腺癌、胃癌和食管癌等多种肿瘤中处于高度甲基化状态，且高甲基化是NDRG4基因失活的主要机制［12-15］。

qMSP法是在甲基化特异性PCR（MSP）的基础建立起的一种基于实时荧光定量PCR的方法，具有高敏感性和高特异性，能够检测出非甲基化等位基因超过甲基化等位基因10 000倍的样品，且与Sanger测序结果高度一致［16-17］。qMSP法根据PCR循环过程中有无扩增曲线及扩增曲线的Ct值来判断检测样品是否发生甲基化及甲基化程度；该方法操作更简便，DNA扩增完成后不需要再进行电泳，大大增加了临床体外诊断应用的可能性，适用于临床高通量样本的检测。本研究利用qMSP法对NDRG4基因启动子CpG岛甲基化进行检测，结果表明结直肠癌组织NDRG4基因启动子甲基化率明显高于癌旁组织；这提示在结直肠癌组织中NDRG4基因启动子多处于甲基化状态，而在正常组织中很少甲基化，NDRG4基因启动子甲基化是肿瘤特异性或肿瘤相关的。此外本研究结果显示，NDRG4基因启动子甲基化与结直肠癌患者年龄、性别、肿瘤生长部位、分化程度、浸润深度、淋巴结转移及TNM分期均无关，这提示NDRG4基因启动子甲基化在结直肠癌发展过程中并非起主要作用，而是结直肠癌发生的早期事件，其发生早于组织病理学的改变。结合既往研究显示结直肠癌组织NDRG4表达显著低于正常结直肠上皮组织［18］，而结直肠癌NDRG4基因启动子处于高甲基化状态；推测NDRG4在结直肠癌的发生过程中是一种肿瘤抑制相关基因，启动子甲基化可能是导致其表达降低的相关机制之一。

大便潜血试验（FOBT）检查和肠镜检查是我国筛查结直肠癌最常见的方法，其中肠镜检查是诊断结直肠癌的金标准，但肠镜检查需进行肠道准备且为有创性，患者的依从性差［19］。此外，肠镜检查漏诊近端结肠肿瘤的比例很高［20］。FOBT是无创性的，但影响因素较多，准确性较低。随着基因检测技术的迅速发展，分子标志物被广泛应用于肿瘤的临床诊断、精准治疗和预后评估。在结直肠癌相关研究中，研究者们认识到DNA甲基化具有组织特异性，稳定存在于患者的组织、血液、粪便和体液中，且DNA甲基化在结直肠癌的发生中具有早期性和普遍性［21］。因此，DNA甲基化具有准确、无创和价格低廉的结直肠癌筛查潜能，有望成为一种新型的结直肠癌早期筛查分子标志物。本研究结果显示，NDRG4基因启动子甲基化诊断结直肠癌的AUC为0.823 2、敏感度为65.12%、特异度为95.83%；提示NDRG4基因启动子甲基化可作为潜在的结直肠癌筛查标志物，对结直肠癌具有一定程度的预测价值，但尚不足以成为独立的结直肠癌筛查分子指标。

综上所述，结直肠癌组织NDRG4基因启动子甲基化率升高，与患者的临床病理参数关系不大，但有助于结直肠癌的诊断，可作为结直肠癌筛查的潜在分子标志物。在后续研究中，我们会将NDRG4基因启动子甲基化检测应用到结直肠癌患者的血清及粪便等无创样本中，并联合其他蛋白或分子指标，进一步探索NDRG4基因启动子甲基化在结直肠癌中的诊断价值。