益生菌联合左卡尼汀口服改善肥胖男性精子DNA碎片化率异常的临床观察

刘春辉，朱晨，陕文生，王志强，王海，周于娜，金莉娅

1甘肃省妇幼保健院男科，兰州 730050；2甘肃省妇幼保健院健康管理中心

肥胖是造成精子质量异常的重要影响因素，无论女方是否进行体质量控制，肥胖男性参与的体外受精（IVF）最终活产率明显低于非肥胖男性参与的IVF［1］。肥胖男性更容易出现精子DNA碎片化率（DFI）过高的问题，且更容易导致女性发生复发性流产，这可能与肥胖人群相关的代谢性内毒素血症有关［2-3］。降低精子DFI的传统治疗方法是服用抗氧化剂，如左卡尼汀、维生素E等，通过将脂肪酸转运到线粒体中进行β-氧化，以产生三磷酸腺苷（ATP）对精子供能，同时催化脂氢过氧化物（Loo-H）产生无害化的羟化物，以降低过氧化脂质的氧化效果，实现保护精子细胞核及精子DNA完整性的目的［4］。此外，使用益生菌可降低肥胖人群的肠道通透性，减少肠道细菌易位，是对抗代谢性内毒素血症与氧化应激的有效方法［5-6］。但在改善肥胖男性精子DFI方面，益生菌联合抗氧化剂较单独使用抗氧化剂治疗是否更具优势尚未可知，为此我们进行了如下研究。

1 资料与方法

1.1 临床资料纳入标准：①DFI≥15%；②BMI≥30 kg/m2；③年龄20～40岁。排除标准：①合并原发性性腺功能减退相关疾病，如Klinefelter综合征、隐睾症或睾丸损伤；②近期服用免疫抑制剂，如非甾体类抗炎药、皮质类固醇或鱼油等；③近期服用可能改变肠道功能的药物，如益生菌、抗生素等；④近期服用激素类药物或抗激素药物，如芳香化酶抑制剂、克罗米芬、枸橼酸他莫昔芬、人绒毛膜促性腺激素或睾酮等；⑤近3个月内曾接受过电离辐射检查，如X线、CT等；⑥合并亚临床生殖道感染［7］。选取2021年1月—12月在我院男科就诊时发现的符合上述标准的精子DFI异常肥胖男性179例，按照随机数字表法分为观察组89例与对照组90例。观察组年龄（27.21±4.31）岁，体质量（92.51±5.01）kg，BMI（32.56±1.92）kg/m2，精子DFI 23.63%±6.84%；对照组年龄（26.53±4.30）岁，体质量（94.31±6.31）kg，BMI（31.56±2.62）kg/m2，精 子DFI 22.14%±7.51%。两组上述资料均具有可比性（P均>0.05）。本研究通过我院医学伦理委员会审核［（2021）GSFY伦审04号］，患者均签署知情同意书。

1.2 治疗方法对照组仅口服抗氧化剂左卡尼汀口服液（东北制药集团沈阳第一制药有限公司生产，国药准字H19990372，规格1 g），每次1 g，3次/天。观察组在对照组治疗的基础上口服益生菌地衣芽孢杆菌活菌胶囊（东北制药集团沈阳第一制药有限公司生产，国药准字S10950019，规格0.25 g），每次0.5 g，3次/天。两组均治疗3个月。

1.3 指标观察方法

1.3.1 疗效两组治疗后根据2002版《世界卫生组织男性不育标准化检查与诊疗手册》及2007版《中药新药临床研究指导原则》评价疗效：治疗后DFI降至正常范围为显效；治疗后DFI虽不正常，但有明显降低，降低幅度≥10%为有效；治疗后DFI无明显变化，或降低幅度<10%，或升高为无效。以显效和有效占总例数的百分比计算总有效率。

1.3.2 精子密度、形态及DFI两组治疗前后采集禁欲2～7 d的精液样本2 mL，经37℃恒温箱孵育液化精液，使用采样器吸取精液样本10 μL，滴加于精子计数池表面，经SSA-ⅡPLUS精子自动检测分析系统计算精子密度。取50 μL精液在载玻片上进行涂片，自然干燥后使用WHO推荐的DIFF-QUICK快速染色试剂盒进行染色，采用全自动精子形态分析软件计算精子正常形态率。采用Attune CytPix成像型流式细胞仪测定DFI。所有操作由同一名检测人员进行，以确保数据的精准性。

1.3.3 血清人连蛋白（Zonulin）、脂多糖结合蛋白（LBP）采用ELISA法。取两组治疗前后的空腹静脉血5 mL，3 500 r/min离心10 min，分离血清。采用ELISA试剂盒检测血清肠道通透性标志物Zonulin、内毒素标志物LBP水平，严格按照试剂盒说明书操作。

1.3.4 精液8-羟基脱氧鸟苷（8OHdG）采用ELISA法。取两组治疗前后的精液，经3 500 r/min离心10 min，采用ELISA试剂盒检测精液氧化应激标志物8OHdG水平，严格按照试剂盒说明书操作。

1.4 统计学方法采用SPSS25.0统计软件。计量资料采用S-W正态性检验，呈正态分布以±s表示，多组间比较采用方差分析，组间比较采用t检验，重复测量数据采用重复测量的方差分析；非正态分布以M（P25，P75）表示，组间比较采用秩和检验。计数资料以n（%）表示，组间数据比较采用χ2检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组疗效比较观察组显效31例、有效35例、无效23例，总有效率74.16%（66/89），对照组分别为15、28、47例及47.78%（43/90）；观察组总有效率明显高于对照组（P<0.05）。

2.2 治疗前后两组精子密度、正常形态率及DFI比较治疗前后两组精子密度、正常形态率比较差异均无统计学意义（P均>0.05）。与治疗前比较，治疗后两组DFI均降低，且观察组降低更明显（P均<0.05）。见表1。

表1 治疗前后两组精子密度、正常形态率及DFI比较［xˉ±s/M（P25，P75）］

2.3 治疗前后两组血清Zonulin、LBP及精液8OHdG水平比较治疗后观察组血清Zonulin、LBP及精液8OHdG水平均低于同组治疗前及对照组治疗后（P均<0.05）。治疗前后对照组上述指标无明显变化（P均>0.05）。见表2。

表2 治疗前后两组血清Zonulin、LBP及精液8OHdG水平比较［ng/mL，M（P25，P75）］

3 讨论

肥胖是21世纪人类面临的重大社会问题，在过去40年中，全球肥胖患病率大幅上升，从1975年的不足1%到2016年的6%～8%［8］。肥胖可诱发多系统疾病，例如高血压、冠心病、胰岛素抵抗、代谢综合征、不孕症等［9-12］。研究发现，肥胖会改变肠上皮通透性，导致肠道细菌易位［13］。过多摄入脂肪可造成肿瘤坏死因子α（TNF-α）、白细胞介素6（IL-6）等多种炎症因子过度表达，从而使Zonulin大量释放。Zonulin是一种由肠上皮和肝脏产生的蛋白，其C端tau样结构域与细胞间紧密连接的细胞骨架重排相关，作用主要是通过调节细胞间紧密连接，从而控制液体、大分子和白细胞在肠腔与循环系统之间的流动，通常被认为是肠通透性标志物［14-15］。研究显示，过度表达的Zonulin可使肠上皮细胞产生宽松的细胞间通道，肠道内细菌则通过此通道易位于肠腔之外［16］。这些肠道内的革兰阴性菌细胞壁上含有大量的免疫刺激物内毒素黏多糖（LPS），当LBP发现循环系统出现了LPS，则迅速与LPS结合形成血清脂多糖结合蛋白—内毒素黏多糖复合物（LBP-LPS），从而激活全身炎症反应［17］。LBP是肝脏合成的糖蛋白，在正常状态下LBP浓度极低，当形成LBP-LPS复合物时，血清LBP迅速升高，可反映代谢性内毒素血症的严重程度［18］。随着全身炎症反应的加剧以及内毒素水平的升高，氧化应激随即发生。白细胞产生的活性氧（ROS）是一种强氧化剂，在攻击侵入循环系统的细菌时，可同时无差别化攻击睾丸间质细胞、精子细胞，可能进一步造成精子发生核自凝、细胞核三级结构受损、精子DNA碎片化改变、精子线粒体膜电位异常等［19］。8OHdG是鸟嘌呤碱基受到氧化攻击而生成的一种氧化加合物，是国际上公认的评价氧化应激严重程度的新型生物指标，精液8OHdG水平升高反映了精液ROS的堆积，提示精子受到了氧自由基的攻击［20］。

传统的改善精子DNA完整性的治疗方法是使用抗氧化剂，如左卡尼汀、天然型维生素E、维生素C等，以及多食用富含超氧化物歧化酶（SOD）的食品。左卡尼汀为水溶性抗氧化剂，是左旋肉碱的通用商品名，通常由食物中摄取或自身合成产生，通过转运长链脂肪酸至线粒体内进行β氧化，为细胞提供能量；绝大多数的内源性左卡尼汀通常以游离形式供应附睾组织，附睾中左卡尼汀浓度约为血浆中的2 000倍，在促使精子成熟的同时，也为精子供能，并促进乙酰基转运出线粒体，以避免乙酰毒素对精子的损害［4］。近年来，益生菌逐渐被应用于肥胖人群这一特殊群体，用以改善肠上皮屏障功能，减少肠道细菌易位，从而减轻炎症和氧化应激反应［20］。研究显示，益生菌可以提高精子质量和睾丸激素水平［19］。但益生菌联合左卡尼汀对于DFI过高是否同样具有治疗效果，目前鲜见报道。

抗氧化剂治疗能够有效改善精子DNA完整性，但对于肥胖人群这一特殊群体，肠道上皮通透性升高而造成的肠道细菌易位是精子DNA完整性受损的重要致病因素，应当在抗氧化剂治疗基础上加用益生菌，从而减少肠道细菌易位，最大程度避免代谢性内毒素血症的出现，以及循环系统来源的ROS对精子细胞核的损伤，这可能是更适合肥胖人群的干预措施。本研究结果显示，与治疗前比较，治疗后两组DFI均降低，且观察组降低更明显，观察组总有效率明显高于对照组，提示在益生菌的基础上加用左卡尼汀可更有效地改善肥胖人群的精子DNA完整性；本研究治疗后观察组血清Zonulin、LBP及精液8OHdG水平均低于同组治疗前及对照组治疗后，提示益生菌对代谢性内毒素血症、氧化应激具有抑制作用，这种优势可能得益于益生菌独特的对肠道细菌易位的抑制作用。高温、精索静脉反流、附睾内血液回流障碍、生殖道感染等多种因素可使睾丸、附睾产生腺体内氧化应激反应，左卡尼汀在阻止腺体内源性氧化应激损害方面发挥了重要作用［4］。而对于循环系统代谢性内毒素血症产生的氧化应激，左卡尼汀作用则相对较弱，而使用益生菌来预防肠道细菌易位，可减少循环系统内产生的氧化应激，则可能是更适合肥胖男性这一群体的抗氧化治疗方案。本研究治疗前后对照组血清Zonulin、LBP及精液8OHdG水平无明显变化，但对DFI仍有较好的改善效果，可能与部分肥胖人群左卡尼汀自身产生不足有关，因此外源性补充左卡尼汀仍可取得较好的DFI改善效果。

综上所述，肥胖可造成肠上皮通透性增加而诱发代谢性内毒素血症，内毒素水平升高可造成全身炎症反应、诱导氧化应激反应，由氧化应激引发循环系统来源的ROS释放会造成精子细胞核损伤、DFI升高。在传统抗氧化治疗的基础上联合益生菌可以增强肥胖人群的肠道屏障功能，减少肠道细菌易位，降低或消除全身炎症反应及氧化应激损伤，从而改善精子DNA完整性。本研究中检测到的精液参数无法完全代表广泛人群，此外还应考虑不同种族人群的遗传背景和表观遗传学差异对实验结果的影响，未来需进一步完善设计进行深入探讨。