miR-145-5p对肾缺血/再灌注损伤大鼠的肾脏保护作用及其机制

李莎莎，刘晓茜，黄静，杜林娜，贾盼攀，李露

西安医学院第一附属医院肾内科，西安 710077

肾缺血/再灌注（I/R）损伤是导致急性肾损伤（AKI）发病和患者死亡的重要因素，目前仍没有有效的治疗方法［1］。自噬是一种高度保守的真核细胞再循环过程，可诱导细胞质成分在溶酶体中被吞噬和降解［2］。自噬被认为在缺血、缺氧、营养缺乏、遗传毒性、感染、未折叠蛋白反应等应激条件下被高度诱导，以上这些均参与了肾I/R损伤的发病过程［3］。然而，目前自噬在肾I/R损伤中发挥保护性还是破坏性的作用仍然存在争议。研究发现，miR-145-5p在心肌和脑组织缺血/再灌注损伤过程中发挥了关键作用［4-5］。本课题组前期研究证实，骨髓间充质干细胞分泌的外泌体将miR⁃145⁃5p传递到肾细胞，并通过减轻氧化应激损伤和炎症反应来抑制细胞凋亡，进而减轻了肾I/R损伤。但目前miR⁃145⁃5p能否通过改变肾组织的自噬水平而减轻肾I/R损伤尚不清楚，且其分子机制亦需进一步探究。2022年3月—8月，本研究观察了miR-145-5p过表达对肾I/R损伤大鼠的肾脏保护作用，并探讨其机制是否与调控自噬和其他信号通路激活有关，为临床以miR-145-5p为靶点治疗肾I/R损伤提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料实验动物：清洁级雄性SD大鼠40只，10～12周龄，体质量（200±20）g，购自空军军医大学实验动物中心，许可证号：SYXK（陕）2019-001。主要试剂：血尿素氮（BUN）、血清肌酐（Scr）试剂盒购自南京建成生物工程研究所，TUNEL检测试剂盒购自瑞士Roche公司，逆转录TaqMan miRNA试剂盒购自美国Thermo公司，AKT特异性抑制剂LY294002购自美国GlpBio公司；促凋亡蛋白Bax、抗凋亡蛋白Bcl-2，蛋白激酶B/雷帕霉素靶蛋白（AKT/mTOR）信号通路相关蛋白磷酸化蛋白激酶B（p-AKT）、蛋白激酶B（AKT）、磷酸化雷帕霉素靶蛋白（p-mTOR）、雷帕霉素靶蛋白（mTOR），自噬相关蛋白微管相关蛋白轻链（LC3）、肌球蛋白样Bcl-2结合蛋白（Beclin1）、自噬相关蛋白5（Atg5）和内参β-ac⁃tin抗体均购自美国Abcam公司；miR-145-5p agomir购自上海吉玛制药技术有限公司。

1.2 动物分组及处理将40只SD大鼠随机分成Sham组、I/R组、I/R+agomir组、I/R+agomir+LY组，每组10只。除Sham组外均建立肾脏I/R损伤模型：腹腔注射2%戊巴比妥钠50 mg/kg进行麻醉，腹腔注射肝素钠500 U，开腹后游离双侧肾脏，切除右肾，夹闭左肾动、静脉60 min后开放，逐层缝合腹壁；Sham组仅给予切开及关闭腹腔操作，不予血管夹闭。I/R+agomir组和I/R+agomir+LY组在I/R操作前3 d经尾静脉注射miR-145-5p agomir 10 nmol/L，I/R+agomir+LY组同时腹腔注射LY294002 50 mg/kg，Sham组和I/R组经尾静脉注射等量PBS溶液。各组分组处理2 d后用戊巴比妥钠麻醉大鼠，心脏穿刺采血处死。4%多聚甲醛固定液经心脏进行全身灌注，待肾脏颜色消退后立即取出肾脏，将右肾组织快速放入1.5 mL冷冻管中，液氮保存；左肾组织沿长轴纵向切开，4%多聚甲醛固定。

1.3 肾组织miR-145-5p检测采用qRT-PCR法。取各组液氮保存的右肾组织，RNA提取试剂盒提取总RNA，并进行逆转录。PCR引物序列：miR-145-5p上游引物5′-GTCCAGTTTTCCCAGGAATCCCT-3′、下 游 引 物5′-GCTGTCAACATACGCTACGTAACG-3′，内参U6上游引物5′-TAAAATCTATACACGAC⁃GGCTTCG-3′、下 游 引 物5′-TACTGTGCGTTTA⁃AGCACTTCGC-3′。使用TaqMan miRNAs检测试剂盒进行PCR反应。PCR反应条件：94℃30 s，94℃5 s，60℃30 s，共40个循环。采用2-ΔΔCt法计算miR-145-5p相对表达量。

1.4 肾功能检测收集各组大鼠的血样，4℃条件下3 000 r/min离心20 min，收集上清。按照BUN、Scr试剂盒说明书操作，检测血清BUN、Scr水平。

1.5 肾组织病理观察采用HE染色。取各组4%多聚甲醛固定的左肾组织，4 μm厚度切片。将石蜡切片在100%二甲苯和二甲苯与乙醇（比例为1∶1）的混合溶液中浸泡15 min，脱蜡，分别在100%、95%和75%乙醇中浸泡1 min，生理盐水清洗。苏木精染色30 min，加入伊红复染，光镜下观察肾组织病理变化。对肾组织损伤情况进行评分，评分为0～4分，分数越高提示肾组织损伤越严重［6］。

1.6 肾组织细胞凋亡检测采用TUNEL法。取各组肾组织石蜡切片，经脱蜡水合后用PBS液小心振荡洗涤，用0.1% Triton X-100打孔5 min。按照TUNEL检测试剂盒说明书，将1号和2号液按照1∶9的比例混合配制，37℃避光孵育1 h后，PBS液振荡洗涤3遍。DAPI对细胞核进行染色，37℃避光孵育5 min。激光扫描共聚焦显微镜照像，以发绿色荧光细胞数占蓝色荧光细胞数的百分比计算细胞凋亡率。

1.7 肾组织LC3B检测采用免疫荧光法。取各组肾组织石蜡切片，经脱蜡水合后用PBS液小心振荡洗涤，0.1% Triton X-100打孔5 min。按照LC3B抗体试剂盒说明书，将LC3B和PBS液按照1∶200的比例混合配制，4℃避光孵育12 h，PBS液振荡洗涤3遍；将荧光二抗和PBS液按照1∶300的比例混合配制，37℃避光孵育2 h，PBS液振荡洗涤3遍。DAPI对细胞核进行染色，37℃避光孵育5 min。激光扫描共聚焦显微镜照像，采用Image J软件分析LC3B免疫荧光强度。

1.8 肾组织AKT/mTOR信号通路及凋亡、自噬相关蛋白检测采用Western blotting法。取各组液氮保存的右肾组织，研磨后提取蛋白，BCA法测定蛋白浓度，进行蛋白定量。将蛋白经聚丙烯酰胺变性凝胶电泳（SDS-PAGE）分离，采用湿转法将蛋白转移到PVDF膜，5%脱脂牛奶室温封闭2 h，加入p-AKT、AKT、p-mTOR、mTOR、Bax、Bcl-2、LC3B、Be⁃clin1、Atg5（稀释比例均为1∶1 000）和β-actin（稀释比例为1∶2 000）一抗，4℃孵育过夜；TBST洗脱3次，加入辣根过氧化物酶标记的羊抗兔、羊抗鼠IgG二抗（稀释比例均为1∶5 000），室温孵育2 h；TBST洗脱3次，通过Bio-Rad照相系统采集照片，采用ImageLab软件分析条带灰度值，以β-actin为内参，计算目的蛋白相对表达量，计算p-AKT/AKT、pmTOR/mTOR及LC3Ⅱ/LC3Ⅰ。

1.9 统计学方法采用SPSS19.0统计软件。计量资料采用Shapiro-Wilk正态性检验，呈正态分布以±s表示，多组间比较采用方差分析，组间比较采用t检验，重复测量数据采用重复测量的方差分析；非正态分布以M（P25，P75）表示，组间比较采用秩和检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠肾组织miR-145-5p表达比较Sham组、I/R组、I/R+agomir组、I/R+agomir+LY组肾组织miR-145-5p相对表达量分别为1.04±0.14、0.46±0.15、1.51±0.18、1.46±0.14；与Sham比较，I/R组miR-145-5p表达明显降低，I/R+agomir组和I/R+agomir+LY组均明显升高（P均<0.01）。

2.2 各组大鼠肾功能指标及肾组织损伤评分比较与Sham组相比，I/R组及I/R+agomir+LY组肾组织切片示肾小球坏死和肥大，小管膨胀及铸型形成；与I/R组相比，I/R+agomir组肾小球坏死和肥大显著减轻，小管膨胀及铸型形成明显减少；见OSID码图1。各组血清BUN、Scr及肾组织损伤评分比较见表1。

表1 各组大鼠血清BUN、Scr及肾组织损伤评分比较（±s）

表1 各组大鼠血清BUN、Scr及肾组织损伤评分比较（±s）

注：与Sham组比较，*P<0.05；与I/R组、I/R+agomir+LY组比较，#P<0.05。

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2.3 各组大鼠肾组织细胞凋亡率及凋亡蛋白表达比较与Sham组比较，I/R+agomir组、I/R组、I/R+agomir+LY组肾组织细胞凋亡率均升高，且I/R组、I/R+agomir+LY组升高更明显（P均<0.05）；各组肾组织细胞凋亡情况见OSID码图2。与Sham组、I/R+agomir组比较，I/R组、I/R+agomir+LY组肾组织促凋亡蛋白Bax表达均升高，抗凋亡蛋白Bcl-2表达均降低（P均<0.05）；见表2和OSID码图3。

表2 各组大鼠肾组织细胞凋亡率及凋亡蛋白表达比较（±s）

表2 各组大鼠肾组织细胞凋亡率及凋亡蛋白表达比较（±s）

注：与Sham组比较，*P<0.05；与I/R组比较，#P<0.05；与I/R+agomir+LY组比较，△P<0.05。

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2.4 各组大鼠肾组织自噬相关蛋白表达比较与Sham组、I/R+agomir组比较，I/R组、I/R+agomir+LY组大鼠肾组织LC3B荧光表达强度、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin1蛋白表达均升高，Atg5蛋白表达均降低（P均<0.05）；见表3和OSID码图4、5。

表3 各组大鼠肾组织自噬相关蛋白表达比较（±s）

表3 各组大鼠肾组织自噬相关蛋白表达比较（±s）

注：与Sham组比较，*P<0.05；与I/R组比较，#P<0.05；与I/R+agomir+LY组比较，△P<0.05。

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2.5 各组大鼠肾组织AKT/mTOR通路相关蛋白达水平比较与Sham组、I/R+agomir组比较，I/R组、I/R+agomir+LY组大鼠肾组织p-AKT/AKT、p-mTOR/mTOR均降低（P均<0.05）；见表4和OSID码图6。

表4 各组大鼠肾组织AKT/mTOR通路相关蛋白表达比较（±s）

表4 各组大鼠肾组织AKT/mTOR通路相关蛋白表达比较（±s）

注：与Sham组比较，*P<0.05；与I/R组比较，#P<0.05；与I/R+agomir+LY组比较，△P<0.05。

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3 讨论

AKI主要由肾I/R损伤、脓毒症和肾毒性药物（如顺铂、环孢素、马兜铃酸）引起，主要特点是通过肾小球滤过率检测到肾功能迅速下降。越来越多的研究证实，自噬参与了肾I/R损伤诱导的AKI［7］。此外，自噬在肾I/R损伤中也起双向调节作用，在肾I/R早期，适当的自噬激活有保护作用。KANG等［8］研究发现，盐酸戊乙奎醚可通过诱导自噬促进肾细胞增殖，并抑制细胞凋亡，进而抑制肾I/R损伤的发生发展。XIE等［9］研究发现，缺血预处理可通过上调自噬流促进自噬，以减轻肾I/R损伤。BIAN等［10］研究发现，自噬缺陷会加重肾损伤，并与C反应蛋白高表达相关。而在肾I/R损伤晚期过度激活自噬反而会加重肾脏损伤，一些抑制过度自噬的制剂被证明对肾I/R损伤具有肾保护作用。TAN等［11］证明，纤维母细胞生长因子10可以通过mTOR途径抑制过度自噬，从而保护肾I/R损伤大鼠的肾功能、减少其肾损伤评分。FANG等［12］研究发现，miR⁃30a⁃5p可通过调节Beclin⁃1/ATG16通路而减轻自噬，从而缓解肾I/R损伤。NAKAGAWA等［13］证明，使用mTOR抑制剂依维莫司诱导自噬反应，加重了AKI患者的肾小管功能障碍。因此，在不同的肾I/R损伤进程中，自噬对细胞存活和死亡有不同的调节功能。肾I/R损伤早期阶段自噬提供了保护作用，但晚期或过度自噬可促进细胞凋亡和后期细胞死亡，导致不可逆的细胞损伤。通过对肾I/R损伤不同阶段自噬进行靶向调节，可以起到缓解肾I/R损伤诱发AKI的作用，从而为预防和治疗肾I/R损伤提供新的治疗方法。本研究结果显示，与Sham组相比，I/R组大鼠肾组织细胞凋亡率、LC3B荧光强度、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ及促凋亡蛋白Bax、Beclin1蛋白表达明显升高，抗凋亡蛋白Bcl-2及Atg5蛋白表达明显下降；这表明在肾I/R损伤大鼠晚期的自噬水平明显上调，通过抑制晚期过度自噬继而减少细胞凋亡可能成为预防和治疗肾I/R损伤的新策略。

多个在体和离体实验已表明，miR-145-5p对多种肾脏疾病的诊断和治疗具有指导意义［14］。有研究发现，miR-145-5p在心肌和脑组织I/R损伤的发生发展中发挥了关键作用［4-5］。近期研究发现，miR-145-5p参与到了细胞自噬的调控过程中［15］。然而，miR-145-5p能否通过调节晚期自噬发挥减轻肾I/R损伤的作用仍待进一步明确。本研究结果显示，与I/R组 相 比，I/R+agomir组 大 鼠 给 予agomir上 调miR-145-5p表达后，可以显著降低大鼠血清BUN、Scr水平及肾组织损伤评分，减少肾组织细胞凋亡率、LC3B荧光强度、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ及促凋亡蛋白Bax、Beclin1蛋白表达，并升高抗凋亡蛋白Bcl-2及Atg5蛋白表达；这表明过表达miR-145-5p对肾I/R损伤大鼠的晚期自噬具有明显抑制作用，进而减轻了肾脏损伤。

自噬激活过程需要通过不同的信号通路介导，AKT/mTOR信号通路是其中重要的一条［16］。AKT又称蛋白激酶B（PKB），是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，正常情况下调节下游多种靶蛋白表达。mTOR是自噬调节中研究最多的靶蛋白之一，细胞中的mTOR以两种复合物的形式存在，即mTOR1和mTOR2，调节自噬的主要为mTOR1［17］。在生长条件下，Ⅰ类PI3K激活丝氨酸/苏氨酸激酶AKT，之后通过一系列的调控使mTOR磷酸化，从而抑制自噬。而在营养饥饿、缺氧等应激下，mTOR信号通路被抑制，从而使自噬顺利被诱导［18］。通过AKT/mTOR信号通路对自噬进行调节，对于自噬介导相关疾病的干预有重要意义。此外，miR-145-5p与AKT/mTOR通路间也存在某种联系。GAO等［19］研究显示，通过海绵化miR-145-5p激活PRKCI/AKT/mTOR通路是circPARD3抑制自噬、促进喉鳞状细胞癌进展和化疗耐药的主要机制。因而，我们进一步猜想miR⁃145⁃5p可能是通过激活AKT/mTOR信号通路而抑制了晚期肾I/R损伤后自噬的过度激活，进而减轻肾I/R损伤。本研究结果显示，与Sham组比较，I/R组大鼠肾组织p-AKT/AKT、p-mTOR/mTOR均下降；与I/R组比较，I/R+agomir组大鼠肾组织中p-AKT/AKT、p-mTOR/mTOR均升高，表明miR⁃145⁃5p与AKT/mTOR信号通路间存在上下游调控关系；而腹腔注射AKT信号特异性抑制剂LY294002后的I/R+agomir+LY组较I/R+agomir组肾组织p-AKT/AKT、p-mTOR/mTOR均降低，提示LY294002阻断AKT/mTOR信号通路的同时，也阻断了miR⁃145⁃5p对肾I/R损伤大鼠晚期自噬的抑制作用，并且逆转了miR⁃145⁃5p对肾I/R损伤大鼠的肾脏保护作用。

综上所述，miR⁃145⁃5p可以通过激活AKT/mTOR信号通路来抑制晚期自噬的过度激活，从而减轻了肾I/R后大鼠的肾损伤，发挥肾脏保护作用。本研究阐明了miR⁃145⁃5p在肾I/R损伤中的保护机制，同时也为临床应用miR⁃145⁃5p作为靶点治疗肾I/R损伤提供了更详实的理论基础。