消岩汤含药血清培养的乳腺癌MCF-7细胞增殖、迁移、侵袭能力变化及其机制

吕艳，耿强，韩燕燕，郑旭，李翀，兰福，赵杰

天津中医药大学第一附属医院病理科 国家中医针灸临床医学研究中心，天津 300381

乳腺癌是全世界女性最常见的恶性肿瘤，2018年全世界女性乳腺癌发病率和病死率分别为46.3/100 000和13.0/100 000，且均呈上升趋势［1］。尽管乳腺癌的诊疗取得了一定进展，但是放、化疗对患者的免疫系统带来的损害不可避免，因此寻求“减毒增效”的治疗方法是目前亟待解决的问题。乳腺癌的病因病机是“正气内虚，毒瘀并存”，治疗乳腺癌应扶正与祛邪相结合，在扶正的基础上解毒祛瘀。消岩汤正是以此为依据组方而成，方以生黄芪、太子参为君药，益气滋阴，扶正驱邪；白花蛇舌草、夏枯草、生牡蛎为臣药，清热解毒，软坚散结；郁金、姜黄为佐药，活血祛瘀，行气解郁。研究表明，消岩汤具有显著改善乳腺癌患者生活质量的功效，但分子机制不明确［2］。circRNA作为一类新型拼接RNA，在乳腺肿瘤的发生、发展中发挥重要作用。最新研究证实，敲低膀胱癌组织中的circRIP2基因可抑制转化生长因子β2（TGF-β2）活性，从而促进膀胱癌进展［3］。TGF-β2是重要的肿瘤免疫功能调节因子，乳腺干细胞中高表达的TGF-β2可诱发上皮—间质转化（EMT）［4-5］。2021年10月—2022年3月，本研究观察了不同浓度消岩汤含药血清对乳腺癌MCF-7细胞增殖、迁移和侵袭能力的影响，并观察其调控机制是否与circRIP2和TGF-β2有关，为探索消岩汤干预乳腺癌细胞生物学行为的分子机制提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料细胞：乳腺癌MCF-7细胞购自中国科学院，使用含10%小牛血清的RPMI 1640细胞培养液，在37℃、5%CO2细胞培养箱中培养，胰蛋白酶溶液消化，每3 d传代一次。动物：BALB/C小鼠40只，体质量18～22 g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，批号：SCXK（京）2021-0006。主要试剂：GAPDH、TGF-β2、丝氨酸苏氨酸激酶2（RIPK2）一抗均购自美国ABclonal公司，TRIzol试剂购自美国Thermo公司，CCK-8试剂盒、Transwell小室均购自美国Millipore公司，无水乙醇、异丙醇均购自中国医药集团有限公司，RT逆转录试剂盒、SuperReal PreMix Plus均购自北京天根生化科技有限公司。

1.2 消岩汤含药血清制备消岩汤配伍组成：黄芪30 g、太子参15 g、郁金10 g、姜黄15 g、夏枯草10 g、生牡蛎15 g、白花蛇舌草10 g，分别按40 g/kg（临床成人日用量的20倍）、20 g/kg、10 g/kg溶解于生理盐水。将30只BALB/C小鼠分为三部分，每部分10只，分别灌胃给予40、20、10 g/kg的消岩汤，每次灌胃间隔24 h，连续3 d。小鼠末次灌胃后禁食禁水，12 h后眼眶取血法采血，无菌分离血清，经56℃、30 min灭活处理后，使用0.22 μm微孔滤膜过滤除菌，-20℃保存备用。另取10只BALB/C小鼠不予灌胃，仅采血获得血清，记为空白鼠血清。

1.3 细胞分组处理取对数生长期的MCF-7细胞，调整细胞密度为2×107/μL，以1×105/孔接种于6孔板，待细胞融合度达到80%，将细胞分为消岩汤含药血清4组、消岩汤含药血清2组、消岩汤含药血清1组、普通牛血清组、空白鼠血清组，依次加入1.2中制备的浓度比为4∶2∶1的消岩汤含药血清、普通10%小牛血清及空白鼠血清，每孔100 μL，均孵育24 h。

1.4 细胞增殖能力观察采用CCK-8法。取“1.3”分组处理的细胞，按1×103/孔接种于96孔板，并设置3个复孔，每孔加入培养基100 μL。分别培养24、48 h，每孔加入CCK-8溶液10 μL，在细胞培养箱内继续孵育4 h，使用酶标仪测定450 nm处的吸光度（OD）值。

1.5 细胞迁移能力观察采用细胞划痕实验。取“1.3”分组处理的细胞，用无菌枪头在长满的细胞中间位置划一直线，小心清洗去除漂浮细胞后（0 h）进行拍照，放入培养箱中进行培养。分别在培养24、48、72 h拍照，测量划痕距离（D）后计算24、48、72 h细胞迁移率。24 h细胞迁移率（%）=（D0 h-D24 h）/D0 h×100%，48 h细胞迁移率（%）=（D0 h-D48 h）/D0 h×100%，72 h细胞迁移率（%）=（D0 h-D72 h）/D0 h×100%。

1.6 细胞侵袭能力观察采用Transwell小室实验。提前准备好Transwell小室，在中间铺Matrigel胶。取“1.3”分组处理的细胞，胰酶消化后将5×105个细胞用培养基重悬至200 μL，加到Transwell上室；Transwell下室加入培养基+10%小牛血清；48 h后擦去Matrigel胶，多聚甲醛固定，结晶紫染色，显微镜拍照后对穿膜细胞进行计数。

1.7 细胞中circRIP2、RIP2及TGF-β2mRNA检测采用qRT-PCR法。采用TRIzol试剂提取各组细胞总RNA，测定RNA浓度和纯度，逆转录合成cDNA。cir⁃cRIP2、RIP2、TGF-β2及内参β-actin的PCR引物设计、合成由大连宝生物公司完成，引物序列见表1。PCR反应体系：2×Super Real PreMix Plus 10 μL，上下游引物各0.5 μL，cDNA 1 μL，用ddH2O补充至20 μL。PCR反应条件：95℃预变性15 min，1个循环；95℃变性10 s，60℃退火20 s，40个循环；72℃延伸20 s。熔解曲线：95℃15 s，60℃60 s，95℃15 s。以β-actin为内参，采用2－ΔΔCt法计算目的基因相对表达量。

表1 circRIP2、RIP2、TGF-β2及内参β-actin引物序列

1.8 细胞中RIPK2、TGF-β2蛋白检测采用West⁃ern blotting法。取各组细胞，提取细胞总蛋白，制备SDS-PAGE胶，电泳，转膜，封闭；加入RIPK2、TGF-β2及内参GAPDH一抗（稀释比例均为1∶1 000），4℃孵育过夜，洗膜；加入二抗（稀释比例为1∶40 000），室温下封闭1 h，洗膜后显色、曝光，Image J软件分析条带灰度值，计算目的蛋白相对表达量。

1.9 统计学方法采用SPSS18.0统计软件。计量资料采用Shapiro-Wilktest正态性检验，呈正态分布以±s表示，多组间比较采用方差分析，组间比较采用t检验和SNK法，重复测量数据采用重复测量方差分析；非正态分布以M（P25，P75）表示，组间比较采用秩和检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组细胞增殖能力比较培养24 h，消岩汤含药血清4、2组细胞增殖能力均低于普通牛血清组（P均<0.05）；培养48 h，消岩汤含药血清4、2、1组细胞增殖能力均低于普通牛血清组，消岩汤含药血清4组细胞增殖能力均低于空白鼠血清组（P均<0.05）。其他两组间同时间点比较均无统计学差异（P均>0.05）。见表2。

表2 各组培养24、48 h的细胞增殖能力比较（±s）

表2 各组培养24、48 h的细胞增殖能力比较（±s）

注：与空白鼠血清组比较，*P<0.05；与普通牛血清组比较，#P<0.05。

?

2.2 各组细胞迁移能力比较见表3及OSID码图1。

表3 各组培养24、48、72 h的细胞迁移率比较（±s）

表3 各组培养24、48、72 h的细胞迁移率比较（±s）

注：与同组24 h比较，*P<0.05；与普通牛血清和空白血清组同时间点比较，#P<0.05。

?

2.3 各组细胞侵袭能力比较消岩汤含药血清4、2、1组及普通牛血清组、空白鼠血清组穿膜细胞数分别为（24±2）、（37±4）、（47±6）、（88±5）、（82±8）个，消岩汤含药血清4、2、1组穿膜细胞数均低于普通牛血清组、空白鼠血清组（P均<0.05），消岩汤含药血清4、2、1组穿膜细胞数比较无统计学差异（P>0.05）。见OSID码图2。

2.4 各组细胞circRIP2及RIP2、TGF-β2mRNA相对表达量比较见表4。

表4 各组细胞circRIP2及RIP2、TGF-β2 mRNA相对表达量比较（±s）

表4 各组细胞circRIP2及RIP2、TGF-β2 mRNA相对表达量比较（±s）

注：与空白鼠血清组比较，*P<0.05；与普通牛血清组比较，#P<0.05。

?

2.5 各组细胞RIPK2、TGF-β2蛋白表达比较消岩汤含药血清4组RIPK2蛋白相对表达量低于空白鼠血清组、消岩汤含药血清1组，TGF-β2蛋白相对表达量低于普通牛血清组（P均<0.05）。见表5及OSID码图3、4。

表5 各组细胞RIPK2、TGF-β2蛋白表达比较（±s）

表5 各组细胞RIPK2、TGF-β2蛋白表达比较（±s）

注：与空白鼠血清组比较，*P<0.05；与普通牛血清组比较，#P<0.05；与消岩汤含药血清1组比较，△P<0.05；

?

3 讨论

消岩汤是天津中医药大学第一附属医院院内制剂，在临床应用数十年，对多种肿瘤包括乳腺癌［4］、非小细胞肺癌和甲状腺癌［6-7］等均有良好疗效。但是，消岩汤治疗各种肿瘤的分子机制尚不明确。研究证实，消岩汤含药血清经Survivin siRNA抑制人肺腺癌A549细胞增殖，并促进其凋亡［8］。此外，消岩汤能够增强毒性T淋巴细胞和自然杀伤（NK）细胞的活性而提高肿瘤患者免疫功能［9-10］。本研究结果显示，培养相同时间点消岩汤含药血清4、2组细胞增殖能力均低于普通牛血清组，消岩汤含药血清4、2、1组24 h细胞迁移率均低于普通牛血清组、空白鼠血清组，消岩汤含药血清4、2组48、72 h细胞迁移率均低于普通牛血清组、空白鼠血清组，消岩汤含药血清4、2、1组穿膜细胞数均低于普通牛血清组、空白鼠血清组；这提示消岩汤含药血清可有效抑制乳腺癌MCF-7细胞的增殖、迁移和侵袭能力，以中高浓度消岩汤含药血清效果更明显。

环状RNA可通过海绵样吸附miRNA对下游基因进行调控，产生后续的表观遗传特性。研究显示，miR-1305是影响乳腺癌患者预后的独立因素之一［11］，而TGF-β2可通过激活Smad3参与调控乳腺癌转移［12］。尽管circRIP2首先是在膀胱癌相关研究中被人们认识，但是鉴于其“海绵样”吸附分子miR-1305以及下游调控蛋白TGF-β2均与乳腺癌进展关系密切。因此，本研究观察了消岩汤含药血清抑制乳腺癌MCF-7细胞增殖、迁移和侵袭能力的相关机制是否与circRIP2有关。cir⁃cRIP2是一个长度为282 bp的环状RNA，不能编码、翻译产生蛋白质，只有在解链状态才能够吸附miR-1305，并对下游调控通路产生作用，并且只有在线性RNA状态下才能够编码产生蛋白RIPK2。最近研究发现，RIPK2活性增加导致了NF-κB的活化，随后促进了乳腺癌的发生和侵袭［13］。本研究结果表明，消岩汤含药血清4组细胞circRIP2相对表达量均低于普通牛血清组、空白鼠血清组，RIP2相对表达量均低于普通牛血清组；消岩汤含药血清4组RIPK2蛋白相对表达量低于空白鼠血清组；这提示高浓度消岩汤含药血清对乳腺癌MCF-7细胞的circRIP2具有抑制作用，同时抑制线性RIP2 mRNA蛋白产物RIPK2表达，可能是其降低乳腺癌细胞增殖、迁移和侵袭能力的相关机制之一，为探索消岩汤通过调控circRIP2而影响乳腺癌进展的分子机制提供了重要线索。

此外，TGF-β2/Smad3通路激活对乳腺癌易感性的影响已被证实［14］。TGF-β2基因敲除可加速乳腺癌T淋巴细胞介导的肿瘤排斥反应，对于乳腺癌的进展具有重要的临床意义［15］。关于TGF-β2及其通路与放疗和化疗耐受的关系是目前研究的焦点［16］，TGF-β2有可能成为突破肿瘤患者放疗、化疗耐药性的关键点［17-18］。本研究结果表明，消岩汤含药血清4组细胞TGF-β2mRNA相对表达量均低于普通牛血清组、空白鼠血清组，TGF-β2蛋白相对表达量低于普通牛血清组；这提示高浓度消岩汤含药血清可能通过抑制乳腺癌MCF-7细胞TGFβ2mRNA和蛋白表达而降低其细胞增殖、迁移和侵袭能力。

综上所述，高浓度消岩汤含药血清可通过降低cir⁃cRIP2、TGF-β2表达而参与抑制乳腺癌MCF-7细胞的增殖、迁移和侵袭。在未来研究中，我们将重点探索cir⁃cRIP2和TGF-β2之间的调控关系及下游蛋白与乳腺癌进展的相关性。