circ_ZNF609/miR-423-5p轴对高糖诱导肾小管上皮细胞HK2凋亡和氧化应激的机制研究

卢迪 黎瑶 梅希 邱平

糖尿病肾病是糖尿病的常见并发症，也是引起终末端肾功能衰竭的主要原因[1]。糖尿病患者长期处于高血糖状态，肾小管上皮细胞经高糖刺激后可产生过度的氧化应激和炎性反应，进一步引起肾小管上皮细胞凋亡或坏死，这也是糖尿病肾病发生的重要原因[2]，因此，抑制高糖诱导的肾小管上皮细胞氧化应激和凋亡对糖尿病肾病的治疗尤为重要。circ_ZNF609是一种环状RNA(circRNA)，参与多种疾病的发生发展。研究显示，circ_ZNF609在胶质瘤、宫颈癌、前列腺癌和胃癌等肿瘤中表达上调，作为促癌基因促进肿瘤发展进程[3-6]。circ_ZNF609可通过靶向miR-22-3p/ENO1轴促进慢性缩窄性损伤(CCI)大鼠炎性因子表达，加重神经型疼痛进展[7]；circ_ZNF609在视网膜神经变性过程中表达上调，沉默其表达可减少视网膜反应性神经胶质增生和神经胶质细胞活化，其有可能成为视网膜神经变性治疗的分子靶点[8]。但是，circ_ZNF609能否影响肾小管上皮细胞氧化应激和凋亡还未知。circRNA可靶向结合微小RNA(miRNA)分子海绵作用调控miRNA靶基因的表达，进而发挥生物学调控作用[9]。Starbase靶基因在线软件预测显示，circ_ZNF609可能靶向结合miR-423-5p。研究显示，miR-423-5p在糖尿病肾病患者肾组织中表达下调，上调miR-423-5p可靶向抑制Nox4减少高糖诱导的足细胞凋亡，并抑制足细胞氧化应激和炎性损伤，miR-423-5p可作为糖尿病肾病治疗的分子靶标[10]。本研究以肾小管上皮细胞HK2为研究对象，主要观察了circ_ZNF609对高糖诱导的HK2细胞凋亡和氧化应激的影响及其能否靶向miR-423-5p发挥作用，以期为糖尿病肾病的治疗提供分子靶点。

1 材料与方法

1.1 细胞与试剂 HK2细胞系，上海通派生物科技有限公司；胎牛血清(FBS)，浙江天杭生物科技有限公司；RNA抽提试剂盒、逆转录试剂盒和PCR试剂盒，大连宝生物；低糖DMEM培养液、Annexin V-FITC/PI细胞凋亡试剂盒、二喹啉甲酸蛋白检测试剂盒和双荧光素酶活性检测试剂盒，北京索莱宝；circ_ZNF609小干扰RNA(si-circ_ZNF609)、乱序无意义阴性序列(si-NC)、miR-423-5p抑制剂(inhibor)、miR-423-5p 模拟物(mimc)、模拟对照序列(miR-NC)及PCR引物，上海生工；LipofectamineTM 2000试剂盒，美国Invitrogen公司；超氧化物歧化酶(SOD)和丙二醛(MDA)检测试剂盒，南京建成；兔抗人Cleaved-caspase3和甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)抗体，中国Abcam公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养：从液氮罐中取出HK2细胞，在超净工作台内复苏。加含10% FBS的低糖DMEM培养液，置于37℃、CO2体积分数5%、湿度97%的培养箱中培养。当细胞密度生长至90%时，0.25%胰蛋白酶消化，传代培养。

1.2.2 RT-qPCR检测circ_ZNF609和miR-423-5p表达：取6孔板中，接种HK2细胞(5.0×105个/孔)。培养12 h后，弃培养液，分组处理。分为对照(NC)组和高糖(HG)组，其中HG组细胞用含25 mmol/L[11]葡萄糖培养液培养，NC组细胞用含等渗透压25 mmol/L甘露醇的培养液培养。培养24 h后，收集细胞。用RNA抽提试剂盒提取细胞中总RNA，经逆转录后，行PCR扩增。引物序列：circ_ZNF609上游5’-CAGCGCTCAATCCTTTGGGA-3’，下游5’-GACCTGCCACATTGGTCAGTA-3’；miR-423-5p上游5’-GTACGACAGCTCGCGTAGC-3’，下游5’-CGTCGCGCTAGGCGA-3’；GAPDH上游5’-CATGAGAAGTATGACAACAGCCT-3’，下游5’-AGTCCTTCCA CGATACCA AAGT-3’；U6上游5’-TGCGGGTGCTCGCTTCGGCAGC-3’，下游5’-CCAGTGCAGGGTCCG AGGT-3’。2-△△Ct法计算circ_ZNF609 相对GAPDH、miR-423-5p相对U6的表达量。

1.2.3 细胞转染：取6孔板中，接种HK2细胞(5.0×105个/孔)。培养12 h后，弃培养液，换为不含FBS的培养液。用LipofectamineTM 2000脂质体法，分别转染si-NC、si-circ_ZNF609、miR-NC、miR-423-5p mimics、共转染si-circ_ZNF609与miR-423-5p inhibor。转染12 h后，更换为常规培养液，再培养24 h，RT-qPCR法检测细胞中circ_ZNF609或miR-423-5p表达验证转染效果，并收集细胞用于后续实验。

1.2.4 CCK-8法检测细胞增殖活性：取96孔板中，接种HK2细胞或转染后的HK2细胞(2.5×104个/孔)，培养12 h后，弃培养液，分组处理。HK2细胞分为NC组和HG组，处理同上述1.2.2。转染si-NC、si-circ_ZNF609、miR-NC、miR-423-5p mimics、共转染si-circ_ZNF609与miR-423-5p inhibor的HK2细胞均用含25 mmol/L葡萄糖的培养液培养，并分别记为HG+si-NC、HG+si-circ_ZNF609、HG+miR-NC、HG+miR-423-5p mimic、HG+si-circ_ZNF609+miR-423-5p inhibor。培养24 h后，每孔加10 μl CCK-8试剂。孵育2 h后，酶标仪(450 nm)检测各孔光密度(OD)值。以NC组细胞存活率为100%。细胞存活率(%)=OD实验组/ODNC组×100%。

1.2.5 流式细胞术检测细胞凋亡：取6孔板中，接种HK2细胞或转染后的HK2细胞(1.0×105个/孔)，培养12 h后，弃培养液，分组处理，同上述1.2.4。培养24 h后，收集各组细胞。用磷酸盐缓冲液清洗2次，加500 μl结合缓冲液，重悬细胞。利用10 μl Annexin V-FITC/PI试剂盒检测各组细胞凋亡。凋亡率(%)=(早期凋亡数+晚期凋亡数)/总细胞数×100%。

1.2.6 蛋白印迹法检测Cleaved-caspase3蛋白表达：细胞接种和分组处理同上述1.2.5，培养24 h后，用RIPA试剂提取各组细胞中总蛋白。用二喹啉甲酸法检测蛋白含量，行10% SDS-PAGE电泳，并将分离蛋白转至PVDF膜，于5%脱脂奶粉中封闭2 h。然后于4℃冰箱中分别用Cleaved-caspase3(1∶500)、GAPDH(1∶1 000)一抗孵育液孵育12 h，洗膜后，再于7℃摇床中用山羊抗兔二抗(1∶2 000)孵育1 h。加化学发光试剂，避光显影，曝光拍照，Image J 软件分析Cleaved-caspase3相对GAPDH的表达量。

1.2.7 试剂盒检测细胞中SOD活性和MDA含量：细胞接种和分组处理同上述1.2.5，培养24 h后，弃培养液。加细胞裂解液充分裂解细胞，收集裂解液离心(3 500 r/min、5 min)，取上清液，分别按照SOD和MDA试剂盒说明书，检测上清中SOD活性和MDA含量。

1.2.8 双荧光素酶报告基因实验：利用PCR技术扩增含miR-423-5p结合位点的circ_ZNF609核苷酸序列，插入pGL3载体，构建circ_ZNF609野生型荧光素酶载体(WT-circ_ZNF609)。利用基因突变技术将结合位点突变，插入pGL3载体，构建circ_ZNF609突变型荧光素酶载体(MUT-circ_ZNF609)，该过程由上海生工生物工程股份有限公司完成。取6孔板中，接种HK2细胞(5.0×105个/孔)。培养12 h后，弃培养液，换为不含FBS的培养液。用LipofectamineTM2000脂质体法，分别共转染WT-circ_ZNF609与miR-NC或miR-423-5p mimic、MUT-circ_ZNF609与miR-NC或miR-423-5p mimic。转染12 h后，更换为常规培养液，再培养24 h，弃培养液，充分裂解细胞。将细胞裂解液离心(3 500 r/min、5 min)，取上清液，检测细胞荧光素酶活性，结果以萤火虫与海肾的荧光强度的比值表示。

2 结果

2.1 高糖对HK2细胞中circ_ZNF609和miR-423-5p表达的影响 与NG组比较，HG组HK2细胞中circ_ZNF609表达量增加(P<0.05)，miR-423-5p表达量减少(P<0.05)。见表1。

表1 高糖对HK2细胞中circ_ZNF609和miR-423-5p表达的影响

2.2 下调circ_ZNF609对高糖诱导的HK2细胞活性和凋亡的影响 转染si-circ_ZNF609的HK2细胞中circ_ZNF609表达量明显低于转染si-NC的细胞(0.19±0.07比 1.00±0.00，t=20.042，P<0.05)，说明下调circ_ZNF609的HK2细胞构建成功。与NG组比较，HG组HK2细胞增殖活性降低(P<0.05)，细胞凋亡率和细胞中凋亡相关蛋白Cleaved-caspase3的表达升高(P<0.05)。与HG组或HG+si-NC组比较，HG+si-circ_ZNF609组HK2细胞增殖活性升高(P<0.05)，细胞凋亡率和细胞中凋亡相关蛋白Cleaved-caspase3的表达降低(P<0.05)。HG组与HG+si-NC组各检测指标比较差异均无统计学意义(P>0.05)。见图1，表2。

图1 下调circ_ZNF609对HK2细胞凋亡的影响；A 下调circ_ZNF609抑制高糖诱导的HK2细胞中Cleaved-caspase3蛋白表达；B 下调circ_ZNF609抑制高糖诱导的HK2细胞凋亡

表2 下调circ_ZNF609对高糖诱导的HK2细胞凋亡的影响

2.3 下调circ_ZNF609对高糖诱导HK2细胞氧化应激的影响 与NG组比较，HG组HK2细胞中SOD活性降低(P<0.05)，MDA含量升高(P<0.05)。与HG组或HG+si-NC组比较，HG+si-circ_ZNF609组HK2细胞中SOD活性升高(P<0.05)，MDA含量降低(P<0.05)。HG组与HG+si-NC组各检测指标比较差异均无统计学意义(P>0.05)。见表3。

表3 下调circ_ZNF609对高糖诱导HK2细胞氧化应激的检测

2.4 circ_ZNF609靶向结合miR-423-5p Starbase靶基因在线软件预测显示circ_ZNF609与miR-423-5p的结合位点。与共转染 WT-circ_ZNF609与miR-NC的HK2细胞比较，共转染WT-circ_ZNF609与miR-423-5p的HK2细胞荧光素酶活性显著降低(P<0.05)；与共转染MUT-circ_ZNF609与miR-NC的HK2细胞比较，共转染MUT-circ_ZNF609与miR-423-5p的HK2细胞荧光素酶活性无明显变化(P>0.05)。同时，转染si-circ_ZNF609的HK2细胞中miR-423-5p表达量明显高于转染si-NC的细胞(2.81±0.27比1.00±0.00，t=11.611，P<0.05)，说明下调circ_ZNF609促进HK2细胞中miR-423-5p的表达。见表4，图2。

表4 双荧光素酶报告活性检测

图2 circ_ZNF609和miR-423-5p的互补序列

2.5 上调miR-423-5p对高糖诱导的HK2细胞凋亡和氧化应激的影响 转染miR-423-5p mimic的HK2细胞中miR-423-5p表达量明显高于转染miR-NC的细胞(2.59±0.24比1.00±0.00，t=11.475，P<0.05)，说明上调miR-423-5p的HK2细胞构建成功。与HG+miR-NC组比较，HG+miR-423-5p mimic组HK2细胞增殖活性升高(P<0.05)，细胞凋亡率和细胞中Cleaved-caspase3蛋白表达降低(P<0.05)，细胞中SOD活性升高(P<0.05)，MDA含量降低(P<0.05)。见表5，图3。

表5 上调miR-423-5p对高糖诱导的HK2细胞凋亡及氧化应激的影响

图3 上调miR-423-5p对HK2细胞凋亡及Cleaved-caspase3蛋白表达的影响；A 上调miR-423-5p抑制高糖诱导的HK2细胞凋亡；B 上调miR-423-5p抑制高糖诱导的HK2细胞中Cleaved-caspase3蛋白表达

2.6 下调miR-423-5p逆转下调circ_ZNF609对高糖诱导HK2细胞凋亡和氧化应激的影响 共转染si-circ_ZNF609与miR-423-5p inhibor的HK2细胞中miR-423-5p 表达量明显低于转染si-circ_ZNF609的细胞，差异有统计学意义(1.16±0.09比2.79±0.25，t=10.625，P<0.05)，说明HK2细胞miR-423-5p下调构建成功。与HG组比较，HG+si-circ-ZNF609组细胞和SOD活性升高(P<0.05)。凋亡率、Cleaved-caspase3、MDA降低(P<0.05)，与HG+si-circ_ZNF609组比较，HG+si-circ_ZNF609+miR-423-5p inhibor组HK2细胞增殖活性降低(P<0.05)，细胞凋亡率和细胞中Cleaved-caspase3蛋白表达升高(P<0.05)，细胞中SOD活性降低(P<0.05)，MDA含量升高(P<0.05)。见表6,图4。

表6 下调miR-423-5p逆转下调circ_ZNF609对高糖诱导HK2细胞凋亡及氧化应激的影响

图4 下调miR-423-5p逆转下调circ_ZNF609对高糖诱导HK2细胞凋亡和Cleaved-caspase3蛋白表达的影响；A 下调miR-423-5p可减弱下调circ_ZNF609对高糖诱导HK2凋亡的抑制作用；B 下调miR-423-5p可减弱下调circ_ZNF609对高糖诱导HK2细胞中Cleaved-caspase3蛋白表达的抑制作用

3 讨论

肾小管上皮细胞损伤是糖尿病肾病发生发展的主要原因，探究影响肾小管上皮细胞损伤的分子机制可为其治疗提供分子靶点。高糖是引起肾小管上皮细胞损伤的主要诱因，其可引起肾小管上皮细胞过度氧化应激，进一步诱导细胞凋亡[12]。本研究结果显示，肾小管上皮细胞HK2经高糖处理后，细胞凋亡加剧，细胞中氧化应激指标MDA含量增加，而SOD活性降低，与Wang等[13]报道结果一致，说明高糖诱导肾小管上皮细胞HK2产生了氧化应激和凋亡。

circRNA是一类结构呈闭合环状的非编码RNA，性质稳定，在真核生物中广泛存在。作为一种circRNA，目前circ_ZNF609对肾小管上皮细胞损伤的影响还未知。本研究结果显示，高糖可促进肾小管上皮细胞HK2中circ_ZNF609的表达，提示circ_ZNF609可能促进高糖诱导的肾小管上皮细胞损伤；通过下调肾小管上皮细胞HK2中circ_ZNF609的表达发现，下调circ_ZNF609可降低高糖诱导的肾小管上皮细胞凋亡率及凋亡相关蛋白Cleaved-caspase3的表达，说明下调circ_ZNF609可减少高糖诱导的肾小管上皮细胞凋亡，减轻了细胞损伤，其可能成为糖尿病肾病治疗的分子靶点。肾小管上皮细胞损伤与炎性反应和氧化应激等密切相关。高糖刺激下，肾小管上皮细胞分泌并释放大量炎性因子，这些炎性因子进一步刺激肾小管上皮细胞产生过度氧化应激反应，引起细胞内脂质过氧化，生成大量MDA[14]。SOD是细胞内重要的抗氧化应酶，其可清除氧自由基减轻氧化应激反应[15]。本研究结果显示，下调circ_ZNF609可明显降低高糖诱导的肾小管上皮细胞中MDA含量，并提高SOD活性，说明下调circ_ZNF609可能通过降低细胞内氧化应激水平减轻高糖诱导的肾小管上皮细胞损伤。

circRNA可发挥miRNA分子海绵作用，调控miRNA靶基因的表达，进而影响细胞凋亡和氧化应激等生理或病理过程[16]。为了进一步探究下调circ_ZNF609抑制高糖诱导的肾小管上皮细胞凋亡和氧化应激的分子机制，本研究证实了circ_ZNF609可靶向结合并负调控miR-423-5p，这与本文HK2细胞经高糖处理后circ_ZNF609表达上调而miR-423-5p表达下调的结果一致。miR-423-5p属于miRNA家族成员，参与调控细胞凋亡、氧化应激及炎性反应，在多种疾病中发挥调控作用。研究显示，芹菜素可能通过上调miR-423-5p并抑制USF2的表达减轻链脲佐菌素(STZ)诱导的糖尿病肾病大鼠肾组织炎症和肾纤维化[17]；上调miR-423-5p可减轻LPS诱导的急性呼吸窘迫综合征(ARDS)大鼠肺损伤、炎症和纤维化[18]；过表达miR-423-5p可通过下调KCTD20减轻MPP诱导的神经细胞SK-N-SH损伤[19]。本研究结果显示，上调miR-423-5p可减少高糖诱导的肾小管上皮细胞凋亡，并抑制细胞氧化应激水平，提示miR-423-5p也可作为减轻高糖诱导的肾小管上皮细胞损伤的分子靶点。此外，本研究结果表明，下调miR-423-5p逆转了下调circ_ZNF609对高糖诱导的肾小管上皮细胞凋亡和氧化应激的抑制作用，进一步提示下调circ_ZNF609通过靶向上调miR-423-5p来阻碍高糖诱导的肾小管上皮细胞凋亡和氧化应激。

综上，高糖促进肾小管上皮细胞中circ_ZNF609的表达，而抑制miR-423-5p表达；下调circ_ZNF609可有效阻碍高糖诱导的肾小管上皮细胞凋亡和氧化应激，其作用机制可能与其靶向结合并上调miR-423-5p表达有关，circ_ZNF609/miR-423-5p轴可能为糖尿病肾病的治疗提供了潜在分子靶点，但尚需进一步在体内进行验证，且miR-423-5p下游靶基因和信号通路对高糖诱导的肾小管上皮细胞损伤的影响也还有待进一步探究。