lncRNA HOXC-AS1靶向miR-382-5p调控ox-LDL诱导的血管内皮细胞损伤实验研究

徐慧 文薏 林琳

动脉粥样硬化是多种心脑血管疾病发生的病理基础，其发病机制较为复杂。氧化型低密度脂蛋白(oxidized low density lipoprotein，ox-LDL)可诱导血管内皮细胞损伤进行促使脂质成分、炎性细胞在损伤部位浸润进而形成粥样斑块，因而减轻ox-LDL诱导的血管内皮细胞损伤成为治疗动脉粥样硬化的重要措施[1,2]。长链非编码RNA(lncRNA)可参与心血管疾病发生及发展过程，并可在动脉粥样硬化中发挥重要调控作用[3,4]。lncRNA HOXC-AS1在ox-LDL诱导的巨噬细胞中表达下调，并可能参与细胞损伤过程[5]。但笔者发现lncRNA HOXC-AS1在动脉粥样硬化发生发展过程中的作用机制尚未可知。LncBase Predicted v.2预测显示lncRNA HOXC-AS1与miR-382-5p存在结合位点。研究表明miR-382-5p在脊髓损伤与小胶质细胞损伤中表达上调，下调其表达可通过抑制炎性反应从而减轻细胞损伤[6]。但lncRNA HOXC-AS1/miR-382-5p在动脉粥样硬化发生发展过程中的作用机制尚未阐明。因此，本研究采用ox-LDL诱导人脐静脉内皮细胞HUVEC建立动脉粥样硬化模型，探讨lncRNA HOXC-AS1是否可通过靶向调控miR-382-5p的表达而参与ox-LDL诱导的血管内皮细胞损伤，报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂 人脐静脉内皮细胞HUVEC购自上海康朗生物；ox-LDL购自美国Sigma；Trizol试剂、Lipofectamine2000购自美国Invitrogen；逆转录与荧光定量PCR试剂购自北京天根生化；pcDNA、pcDNA-lncRNA HOXC-AS1、anti-miR-NC、anti-miR-382-5p、miR-NC、miR-382-5p mimics、si-NC、si-lncRNA HOXC-AS1购自广州锐博生物；MTT、细胞凋亡检测试剂盒、双荧光素酶活性检测试剂盒购自北京索莱宝；双荧光素酶报告基因载体购自美国Promega；IL-1β、IL-6、TNF-α检测试剂盒购自上海酶联生物；兔抗人Cleaved-caspase-3抗体与HRP标记的山羊抗兔IgG二抗购自美国Abcam。

1.2 方法

1.2.1 实验分组:HUVEC细胞接种于96孔板(3×103个/孔)，用含有浓度为100 mg/L ox-LDL的DMEM的培养基培养24 h[7]，记为ox-LDL组。同时将正常培养的HUVEC细胞记为NC组。参照Lipofectamine2000转染试剂说明书，将pcDNA、pcDNA-lncRNA HOXC-AS1、anti-miR-NC、anti-miR-382-5p、pcDNA-lncRNA HOXC-AS1和miR-NC、pcDNA-lncRNA HOXC-AS1和miR-382-5p mimics分别转染至HUVEC细胞，转染成功后用含有浓度为100 mg/L ox-LDL的DMEM的培养基培养24 h，分别记为pcDNA+ox-LDL组、pcDNA-lncRNA HOXC-AS1+ox-LDL组、anti-miR-NC+ox-LDL组、anti-miR-382-5p+ox-LDL组、pcDNA-lncRNA HOXC-AS1+miR-NC+ox-LDL组、pcDNA-lncRNA HOXC-AS1+miR-382-5p+ox-LDL组。

1.2.2 MTT检测细胞增殖：取对数生长期HUVEC细胞接种于96孔板(3×103个/孔)，用含有浓度为25、50、100 mg/L ox-LDL的DMEM的培养基培养24 h，每孔加入质量浓度为5 mg/ml的MTT溶液20 μl，于37℃、体积分数5%CO2培养箱继续培养4 h，弃上清，每孔加入150 μl DMSO，避光振荡孵育5 min，应用酶标仪检测各孔吸光度值。

1.2.3 qRT-PCR检测lncRNA HOXC-AS1、miR-382-5p的表达水平：采用Trizol试剂分别提取各组HUVEC细胞总RNA，反转录体系：5×g DNA Buffer 2 μl，10×King RT Buffer 2 μl，FastKing RT Enzyme Mix 1 μl，FQ-RT Primer Mix 2 μl，RNA(2 μg)，RNase-Free ddH2O补足体系至20 μl；反应条件：42℃ 15 min，95℃ 3 min。以cDNA为模板进行qRT-PCR扩增，反应条件：95℃预变性2 min，95℃变性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，共40次循环。应用ABI StepOnePlus荧光定量PCR仪检测基因相对表达量。

1.2.4 ELISA法检测IL-1β、IL-6、TNF-α的水平：收集各组HUVEC细胞培养上清液，采用ELISA法检测IL-1β、IL-6、TNF-α的水平，严格按照试剂盒说明书进行操作。

1.2.5 流式细胞术检测细胞凋亡率:用胰蛋白酶消化各组HUVEC细胞制备单细胞悬液(5×105个/ml)，取1 ml细胞悬液经3 000 r/min转速离心5 min，弃上清，预冷PBS洗涤，加入400 μl结合缓冲液，分别加入5 μl Annexin V-FITC与5 μl PI，室温避光孵育15 min，于1 h内用流式细胞仪检测细胞凋亡率。

1.2.6 双荧光素酶报告实验检测lncRNA HOXC-AS1与miR-382-5p的靶向关系:lncRNA HOXC-AS1与miR-382-5p的结合位点克隆至pGL3质粒中构建野生型载体lncRNA HOXC-AS1-WT，点突变试剂盒将结合位点进行突变后克隆至pGL3质粒中构建突变型载体lncRNA HOXC-AS1-MUT，采用脂质体转染法将上述载体分别与miR-NC或miR-382-5p mimics共转染至HUVEC细胞，培养48 h后用双荧光素酶活性检测试剂盒检测细胞的荧光素酶活性。

1.2.7 Western blot检测Cleaved-caspase-3蛋白表达量:收集各组HUVEC细胞加入500 μl RIPA裂解液裂解细胞并提取细胞总蛋白，取40 μg蛋白进行SDS-PAGE电泳，转膜后用5%脱脂牛奶封闭2 h，加入1∶800稀释的Cleaved-caspase-3一抗与1∶1 000稀释的内参β-actin抗体后4℃孵育过夜，加入1∶3 000稀释的二抗后37℃孵育2 h，应用Quantity One软件对蛋白条带进行定量。

2 结果

2.1 不同浓度ox-LDL对HUVEC细胞活性的影响 与NC组比较，25 mg/L ox-LDL组、50 mg/Lox-LDL组、100 mg/L ox-LDL组细胞活力降低(P<0.05)，其中ox-LDL浓度为100 mg/L时细胞活力相对较低，因而选用100 mg/L ox-LDL进行后续实验。见表1。

表1 不同浓度ox-LDL对HUVEC细胞活性的影响

2.2 经ox-LDL处理的HUVEC细胞中，lncRNA HOXC-AS1和miR-382-5p表达情况 与NC组比较，ox-LDL组lncRNA HOXC-AS1的表达量降低(P<0.05)，miR-382-5p的表达量升高(P<0.05)。见表2。

表2 经ox-LDL处理的HUVEC细胞中，lncRNA HOXC-AS1和miR-382-5p表达情况

2.3 pcDNA-lncRNA HOXC-AS1抑制ox-LDL诱导的HUVEC细胞凋亡和炎性反应 与NC组比较，ox-LDL组IL-1β、IL-6、TNF-α的水平升高(P<0.05)，细胞凋亡率和Cleaved-caspase-3蛋白水平升高(P<0.05)；与pcDNA+ox-LDL组比较，pcDNA-lncRNA HOXC-AS1+ox-LDL组IL-1β、IL-6、TNF-α的水平降低(P<0.05)，细胞凋亡率和Cleaved-caspase-3蛋白水平降低(P<0.05)。见图1，表3。

图1 pcDNA-lncRNA HOXC-AS1抑制ox-LDL诱导的HUVEC细胞凋亡和相关蛋白表达；A Western Blot检Cleaved-caspase-3蛋白的表达；B 流式细胞仪检测细胞凋亡

表3 pcDNA-lncRNA HOXC-AS1抑制ox-LDL诱导的HUVEC细胞凋亡和炎性反应

2.4 anti-miR-382-5p抑制ox-LDL诱导的HUVEC细胞凋亡和炎性反应 与anti-miR-NC+ox-LDL组比较，anti-miR-382-5p+ox-LDL组IL-1β、IL-6、TNF-α的水平降低(P<0.05)，细胞凋亡率和Cleaved-caspase-3蛋白水平降低(P<0.05)。见图2，表4。

表4 anti-miR-382-5p抑制ox-LDL诱导的HUVEC细胞凋亡和炎性反应

图2 anti-miR-382-5p抑制ox-LDL诱导的HUVEC细胞凋亡和相关蛋白表达；A 流式细胞仪检测细胞凋亡；B Western Blot检Cleaved-caspase-3蛋白的表达

2.5 lncRNA HOXC-AS1靶向miR-382-5p，调控miR-382-5p的表达 lncRNA HOXC-AS1与miR-382-5p存在结合位点。miR-382-5p过表达可抑制野生型载体lncRNA HOXC-AS1-WT的荧光素酶活性(P<0.05)。lncRNA HOXC-AS1可靶向结合miR-382-5p。与pcDNA组比较，pcDNA-lncRNA HOXC-AS1组miR-382-5p的表达量降低(P<0.05)；与si-NC组比较，si-lncRNA HOXC-AS1组miR-382-5p的表达量升高(P<0.05)。见图3，表5、6。

图3 LncBase Predicted v.2对miR-382-5p和lncRNA HOXC-AS1结合进行预测

表5 双荧光素酶活性检测

表6 qRT-PCR检测miR-382-5p 的表达

2.6 miR-382-5p可以逆转pcDNA-lncRNA HOXC-AS1对ox-LDL诱导的HUVEC细胞凋亡和炎性反应的影响 与pcDNA-lncRNA HOXC-AS1+miR-NC+ox-LDL组比较，pcDNA-lncRNA HOXC-AS1+miR-382-5p+ox-LDL组IL-1β、IL-6、TNF-α的水平升高(P<0.05)，细胞凋亡率和Cleaved-caspase-3蛋白水平升高(P<0.05)。见图4，表7。

图4 miR-382-5p可以逆转pcDNA-lncRNA HOXC-AS1对ox-LDL诱导的HUVEC细胞凋亡和相关蛋白表达；A 流式细胞仪检测细胞凋亡；B Western Blot检Cleaved-caspase-3蛋白的表达

表7 miR-382-5p可以逆转pcDNA-lncRNA HOXC-AS1对ox-LDL诱导的HUVEC细胞凋亡和炎性反应的影响

3 讨论

ox-LDL促使血管内皮细胞损伤是造成动脉粥样硬化发生及发展的重要原因，炎性反应与脂质沉积均可能引起血管内皮细胞损伤[8]。lncRNA在肿瘤、炎症性疾病等多种疾病中可发挥重要调控作用，并可通过充当miRNA竞争性内源RNA分子而调节其靶基因表达进而参与动脉粥样硬化发生及发展过程[9,10]。

笔者发现目前lncRNA HOXC-AS1在ox-LDL诱导的血管内皮细胞中的表达尚未可知。既往研究显示，lncRNA HOXC-AS1在胃癌中表达上调，并可促进胃癌细胞增殖及转移[11,12]。本研究数据显示，ox-LDL诱导的血管内皮细胞中lncRNA HOXC-AS1的表达量降低，提示lncRNA HOXC-AS1可能参与动脉粥样硬化发生及发展过程。本研究结果显示，ox-LDL诱导的血管内皮细胞中IL-1β、IL-6、TNF-α的水平升高，与既往相关研究报道结果[13]相似，提示成功建立动脉粥样硬化模型。本研究发现，上调lncRNA HOXC-AS1表达可降低ox-LDL诱导的血管内皮细胞中IL-1β、IL-6、TNF-α的水平，提示lncRNA HOXC-AS1过表达可抑制ox-LDL诱导的血管内皮细胞炎性反应。炎性反应加剧可进一步促使细胞凋亡，本研究结果显示，ox-LDL诱导的血管内皮细胞凋亡率和Cleaved-caspase-3蛋白水平升高，与既往研究报道结果[14]相似，上调lncRNA HOXC-AS1表达可降低ox-LDL诱导的血管内皮细胞凋亡率和Cleaved-caspase-3蛋白水平，提示lncRNA HOXC-AS1过表达可抑制ox-LDL诱导的血管内皮细胞凋亡。

本研究初步证实lncRNA HOXC-AS1序列上含有miR-382-5p的反应元件，lncRNA HOXC-AS1可竞争性结合miR-382-5p。研究表明miR-382-5p在急性肺损伤[15]、类风湿性关节炎[16]、婴儿血管瘤[17]等多种疾病中表达异常，并可调节细胞增殖及凋亡。本研究结果显示，ox-LDL诱导的血管内皮细胞中miR-382-5p的表达量升高，抑制miR-382-5p表达可抑制ox-LDL诱导的血管内皮细胞炎性反应及细胞凋亡，而上调其表达可逆转lncRNA HOXC-AS1过表达对ox-LDL诱导的血管内皮细胞炎性反应及细胞凋亡的抑制作用。提示lncRNA HOXC-AS1可通过靶向调控miR-382-5p表达而参与动脉粥样硬化发生及发展过程。

综上所述，ox-LDL诱导的血管内皮细胞中lncRNA HOXC-AS1表达下调，miR-382-5p表达上调，lncRNA HOXC-AS1可靶向结合miR-382-5p，lncRNA HOXC-AS1过表达可通过抑制miR-382-5p表达而抑制ox-LDL诱导的血管内皮细胞炎性反应及细胞凋亡从而减轻细胞损伤，为明确lncRNA HOXC-AS1在动脉粥样硬化中的作用奠定实验基础，还可为动脉粥样硬化性心血管疾病的预防及治疗提供新方向。但关于其具体作用机制仍需进一步探究。