LncRNA BDNF-AS靶向miR-765影响缺氧缺糖诱导的PC12细胞神经损伤的实验研究

蒋邦治 唐永刚 韩志安 陈林坤 韦家俊

缺血性脑中风是常见的急性脑血管类疾病，也是造成残疾的主要神经系统疾病，氧化应激、炎性反应、细胞凋亡等系列病理过程参与其发生发展；神经保护治疗是缺血性脑卒中最重要、最有效的治疗手段[1,2]。研究表明lncRNA参与调控脑缺血后细胞凋亡、血管生成和炎性反应等系列过程，可作为缺血性脑卒中生物标志物[3]。脑源性神经营养因子反义RNA(BDNF-AS)是一种天然反义转录物，有报道精神分裂症患者血清中lncRNA BDNF-AS呈高表达，与认知能力相关指标密切相关[4]。下调LncRNA BDNF-AS表达对布比卡因诱导的幼脊髓背根神经节神经元的毒性损伤有保护作用[5]。沉默LncRNA BDNF-AS通过抑制细胞凋亡和氧化应激来减弱Aβ25-35诱导的PC12细胞神经毒性[6]。敲除LncRNA BDNF-AS可通过BDNF-TrkB-PI3K/Akt信号通路减弱缺氧/复氧诱导的神经细胞凋亡[7]。而LncRNA BDNF-AS对缺氧缺糖诱导的PC12细胞神经损伤的影响及机制尚不清楚。研究表明miRNA在缺血性脑卒中的发生与发展过程中发挥着重要作用，并参与了脑损伤后的保护和修复机制的调控[8]。敲低LncRNA FOXD3-AS1通过miR-765/BCL2L13轴防止脑缺血/再灌注损伤[9]。本实验研究LncRNA BDNF-AS是否通过调控miR-765影响缺氧缺糖诱导的PC12细胞神经损伤。为神经元损伤的机制以及防治药物研究提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料 PC12细胞(美国ATCC)；DMEM培养基(美国Gibco公司)；Trizol试剂、荧光定量PCR试剂盒(大连宝生物)；凋亡检测试剂盒、蛋白裂解液(艾美捷科技有限公司)；丙二醛(MDA)、超氧化歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)检测试剂盒(南京建成生物工程研究所)；双荧光素酶报告基因检测试剂盒(上海翌圣生物)。

1.2 细胞处理与分组 PC12细胞常规培养于DMEM培养基中，取对数生长期细胞，将其接种于无糖培养液后在含95N2%、5% CO2的培养箱中缺氧缺糖处理12 h，记为模型组，常规培养的细胞作为对照组；将LncRNA BDNF-AS干扰表达载体及阴性对照、miR-765模拟物及阴性对照转染至PC12细胞后进行缺氧缺糖处理，记为si-LncRNA BDNF-AS+模型组、si-NC+模型组、miR-765+模型组、miR-NC+模型组；将LncRNA BDNF-AS干扰表达载体分别与miR-765抑制剂及阴性对照转染至PC12细胞后进行缺氧缺糖处理，记为anti-miR-NC+si-LncRNA BDNF-AS+模型组、anti-miR-765+si-LncRNA BDNF-AS+模型组。

1.3 实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测LncRNA BDNF-AS和miR-765的表达水平 提取各组细胞总RNA，反转录成cDNA，按照荧光定量试剂盒说明进行PCR，相对表达量用2-△△Ct法计算。以GAPDH和U6为内参，LncRNA BDNF-AS上游引物序列：5’-TCACATCTTAGCCCCTTAGCC-3’，下游引物序列：5’-TTTAGCACCCAACAGAATCCC-3’；GAPDH上游引物序列：5’-CGGATTTGGTCGTATTGGG-3’，下游引物序列：5’-TGCTGGAAGATGGTGATGGGATT-3’；miR-765上游引物序列：5’-CGGCTCGGATCCGTTAG-3’，下游引物序列：5’-CGACTACCGTTAGCTAGA-3’；U6上游引物序列：5’-CGCTTCGGCAGGCATTATATAC-3’，下游引物序列：5’-AAGGGGCCATGCTAATCTT-3’。

1.4 流式细胞术检测细胞凋亡 收集各组细胞，用预冷的PBS漂洗2次，与500 μl的结合缓冲液混匀，然后加入10 μl的Annexin V-FITC和5 μl的PI，混匀、避光孵育10 min；上流式细胞仪检测细胞凋亡率。

1.5 蛋白质印迹法检测蛋白表达 提取各组细胞总蛋白，进行SDS-PAGE电泳，转膜、封闭后加入Cleaved-caspase3、Bax抗体(1∶800)，4℃孵育过夜，洗膜后加入二抗(1∶2000)室温孵育2 h，曝光显影，定影，分析蛋白条带灰度值，以β-actin为参照。

1.6 酶联免疫吸附法(ELISA)检测MDA、SOD、CAT水平 收集各组细胞及细胞培养上清液，具体按照试剂盒操作进行检测。

1.7 双荧光素酶报告实验 构建含有miR-765结合位点的LncRNA BDNF-AS野生型及突变型报告基因载体，将其分别与miR-NC、miR-765共转染至PC12细胞，用试剂盒法检测细胞荧光素酶活性。

2 结果

2.1 缺氧缺糖诱导的PC12细胞中LncRNA BDNF-AS和miR-765的表达水平 与对照组相比，模型组LncRNA BDNF-AS表达水平升高，miR-765表达水平降低(P<0.05)。见表1。

表1 缺氧缺糖诱导的PC12细胞中LncRNA BDNF-AS和miR-765的表达水平

2.2 低表达LncRNA BDNF-AS对缺氧缺糖诱导的PC12细胞神经损伤的影响 与对照组相比，模型组LncRNA BDNF-AS表达水平升高，PC12细胞凋亡率以及Cleaved-caspase-3、Bax蛋白表达水平升高，MDA含量升高，SOD和CAT活性降低(P<0.05)；与si-NC+模型组比较，si-LncRNA BDNF-AS+模型组LncRNA BDNF-AS表达水平降低，PC12细胞凋亡率以及Cleaved-caspase-3、Bax蛋白表达降低，MDA含量降低，SOD和CAT活性升高(P<0.05)。见表2，图1、2。

图1 低表达LncRNA BDNF-AS对缺氧缺糖诱导的PC12细胞凋亡的影响

表2 低表达LncRNA BDNF-AS对缺氧缺糖诱导的PC12细胞神经损伤的影响

2.3 LncRNA BDNF-AS靶向调控miR-765的表达 LncBase Predicted v.2预测显示LncRNA BDNF-AS和miR-765有结合位点。miR-765与LncRNA BDNF-AS野生型报告质粒共转染后PC12细胞荧光素酶活性降低(P<0.05)。与pcDNA-NC比较，pcDNA-LncRNA BDNF-AS组LncRNA BDNF-AS表达水平升高，miR-765表达水平降低(P<0.05)；与si-NC比较，si-LncRNA BDNF-AS组LncRNA BDNF-AS表达水平降低，miR-765表达水平升高(P<0.05)。见图3，表3、4。

图2 低表达LncRNA BDNF-AS对缺氧缺糖诱导的PC12细胞相关蛋白表达的影响

图3 LncBase Predicted v.2对LncRNA BDNF-AS和miR-765结合进行预测示意图

表3 miR-NC或miR-765与LncRNA BDNF-AS野生型及突变型报告质粒共转染PC12细胞后双荧光素酶活性

表4 qRT-PCR检测miR-765和LncRNA BDNF-AS的表达

2.4 miR-765对缺氧缺糖诱导的PC12细胞神经损伤的影响 与miR-NC+模型组比较，miR-765+模型组miR-765表达水平升高，PC12细胞凋亡率以及Cleaved-caspase-3、Bax蛋白表达水平降低，MDA含量降低，SOD和CAT活性升高(P<0.05)。见图4，表5。

表5 miR-765对缺氧缺糖诱导的PC12细胞神经损伤的影响

图4 miR-765对缺氧缺糖诱导的PC12细胞凋亡以及相关蛋白表达的影响；A 流式细胞仪检测细胞凋亡；B Western blot检测Cleaved-caspase-3、Bax蛋白的表达

2.5 anti-miR-765可以逆转低表达LncRNA BDNF-AS对缺氧缺糖诱导的PC12细胞神经损伤的影响 与anti-miR-NC+si-LncRNA BDNF-AS+模型组比较，anti-miR-765+si-LncRNA BDNF-AS+模型组miR-765表达水平降低，PC12细胞凋亡率以及Cleaved-caspase-3、Bax蛋白表达水平升高，MDA含量升高，SOD和CAT活性降低，差异均有统计学意义(P<0.05)。见图5，表6。

表6 anti-miR-765可以逆转低表达LncRNA BDNF-AS对缺氧缺糖诱导的PC12细胞神经损伤的影响

图5 anti-miR-765可以逆转低表达LncRNA BDNF-AS对缺氧缺糖诱导的PC12细胞凋亡以及相关蛋白表达的影响；A 流式细胞仪检测细胞凋亡；B Western blot检测Cleaved-caspase-3、Bax蛋白的表达

3 讨论

缺血性脑卒中是脑组织血液供应障碍导致脑组织局限性或弥漫性缺血缺氧，一种缺血性脑血管疾病，死亡率和致残率较高，研究在缺血性脑卒中的发生发展机制，寻找重要治疗靶点以开发药物促进神经功能恢复，为临床策略提供宝贵的见解[10,11]。有研究报道抑制LncRNA BDNF-AS可挽救缺氧/复氧损伤的小鼠心肌细胞中的细胞死亡和凋亡[12]。敲低LncRNABDNF-AS通过miR-130b-5p/PRDM5 轴在急性脊髓损伤中抑制神经元细胞凋亡[13]。沉默LncRNA BDNF-AS可减轻缺氧/缺血引起的新生儿脑损伤[14]。抑制LncRNA BDNF-AS通过增加BDNF的水平来保护视网膜神经节细胞免受缺血损伤[15]。以上研究表明LncRNA BDNF-AS参与调控多种细胞损伤过程。本结果显示，缺氧缺糖诱导的PC12细胞中LncRNA BDNF-AS表达水平升高(P<0.05)；抑制LncRNA BDNF-AS表达后，PC12细胞凋亡率、Cleaved-caspase3和Bax表达水平降低(P<0.05)，MDA含量降低(P<0.05)，SOD和CAT活性升高(P<0.05)；表明抑制LncRNA BDNF-AS表达可抑制缺氧缺糖诱导的PC12细胞凋亡和氧化应激；提示抑制LncRNA BDNF-AS表达可保护PC12细胞免受缺氧缺糖诱导的损伤。这与其他研究中LncRNA BDNF-AS的作用相似。

生物学软件预测发现LncRNA BDNF-AS与miR-765有结合位点。有研究报道miR-765在中枢神经系统肿瘤中下调表达[16]。LINC00173通过靶向miR-765/NUTF2轴促进胶质瘤进展[17]。本结果显示，缺氧缺糖诱导的PC12细胞中miR-765表达水平降低；过表达miR-765后，PC12细胞凋亡率、Cleaved-caspase3和Bax表达水平降低，MDA含量降低，SOD和CAT活性升高；表明过表达miR-765可抑制缺氧缺糖诱导的PC12细胞凋亡和氧化应激。且本实验还证实LncRNA BDNF-AS靶向调控miR-765；而抑制miR-765可以逆转低表达LncRNA BDNF-AS对缺氧缺糖诱导的PC12细胞神经损伤的影响。

综上所述，抑制LncRNA BDNF-AS表达通过靶向调控miR-765抑制缺氧缺糖诱导的PC12细胞神经损伤。