胎儿α-地中海贫血无创基因检测的临床可行性研究*

刘 洁，王晓贤，林雨虹，林 伟

福建医科大学附属福州市第一医院，福建 福州 350009

地中海贫血（以下简称地贫）是一种遗传性溶血性疾病，它的发病原因为珠蛋白基因缺陷，进而引起血红蛋白合成障碍导致贫血，是世界上发病率最高的单基因遗传疾病。地贫主要分布在包括我国南方在内的世界上热带和亚热带疟疾高发地区［1］，福建省地贫总携带率为4.41%，其中，α-地贫占72.4%［2］。

地贫根据其基因改变的类型不同，主要分为α-地贫和β-地贫。β-地贫主要由β基因的点突变所致。α-地贫又分为缺失型α-地贫和非缺失型α-地贫，α-地贫大多数是由于α珠蛋白基因的缺失所致，即缺失型α-地贫,常见的变异类型有-α3.7/、-α4.2/、--SEA/；α-地贫少数由基因点突变造成即非缺失型α-地贫,常见的变异类型有αWSα、αCSα、αQSα［3-5］。α-地贫表型的严重程度与染色体的单倍型密切相关，其中，两个α基因都发生变异的疾病表型程度严重一些，轻者可无临床症状，重者可致死、致残、因而严重威胁人类健康。此外，部分点突变导致的α-地贫（如HbCS、HbQS）合并轻型α-地贫（--/α）表型加重，即（--/αCSα）和（--/αQSα）可能比（--/-α）更严重［6］。其中，巴氏胎儿水肿综合征为最常见遗传病，该疾病是HBA基因中由纯合SEA缺失（--/--）引起［7］。携带巴氏水肿胎的孕妇通常会增加围产期并发症的风险，如先兆子痫和产后出血［8］，危害孕妇及胎儿健康。

目前，对于地贫的检测主要是依赖绒毛活检、羊水穿刺及脐血穿刺等有创方法获得胎儿基因信息，检测时间窗较窄、具有胎儿损伤风险、实验室诊断周期较长、工作量大。因此，临床上需要更早期、快速、精准、无创、安全的检测方法。尽管有报道［9-10］显示，超声方法可以发现巴氏水肿胎，但该指标缺乏特异性，不能有效预测地中海贫血的发生。分子诊断方法仍是预测地中海贫血的首选方法，随着无创产前筛查（non-invasive prenatal testing，NIPT）染色体异常的技术得以应用和成熟，孕妇血浆中胎儿DNA成分成为检测胎儿基因组的重要工具，相较于有创方法取样更简便，更容易被接受。胎盘来源于母体血浆的游离胎儿DNA（circulation free fetal DNA，cffDNA）的存在，使得非侵入性工具的发展能够从母体血液中检测胎儿基因异常。目前，常见非整倍体（如唐氏综合征）的NIPT在临床上可用作筛查试验，其准确率大于99.9%［11-12］。最近，NIPT也可用于某些基因组微缺失（如DiGeorge综合征、Cri-du-chat综合征）。因此，有望基于cffDNA开展对α-地贫基因进行检测，判断胎儿的α-地贫基因型。

1 材料与方法

1.1 研究对象

选取2018年10月—2021年4月福州市第一医院就诊及转诊的22个α-地贫基因携带家系的孕妇作为研究对象，所有家系均携带α-地贫基因突变，除去家系2、21和22外（表1），所有家系的胎儿均有患巴氏胎儿水肿综合征的风险。本研究不影响孕妇自身的临床检查流程。

表1 22例家系中无创产前检测与有创诊断结果情况

1.2 方法

1.2.1 孕妇及其配偶血液采集和处理 用EDTA抗凝采血管从孕妇和其丈夫前臂收集2 mL外周血，参照地贫基因检测试剂盒（PCR-反向点杂交法）（亚能生物）说明书，检测孕妇及其丈夫的地贫基因型。此外，在孕妇抽取羊水前，用EDTA抗凝采血管从孕妇前臂收集5mL外周血。采血后3 h内在4℃下进行两次1 600 g离心10min的方法分离血浆，然后取其中1.2 mL血浆，使用MagPure circulating DNA kit提取游离DNA，然后在-80℃下保存。

1.2.2 羊水标本采集和处理 入组孕妇在妊娠16～22周时，行羊膜腔穿刺术，抽取20 mL羊水。参照地中海贫血基因检测试剂盒（PCR-反向点杂交法）（亚能生物）说明书，检测胎儿地贫基因型。1.2.3 胎儿无创性地贫基因检测 从冰箱取出游离DNA，根据Ion Plus Fragment library kit（Thermo-Fisher Scientific）说明书进行文库构建，在文库构建过程中使用带有8-bp随机标签［13-14］的接头替代原有接头。采用特定区域捕获探针富集文库，捕获区域中包含HBA和HBB区域，以及全基因组上2 088个质控SNP位点。使用定量试剂和QPCR定量扩增仪（ABI公司StepOnePlus）对文库DNA进行定量，得到文库浓度。随后在博奥生物的BES4000基因测序平台完成测序。测序数据下机后，过滤短序列和低质量数据，然后使用BWA软件比对到参考基因组（hg19）。接着，根据公式1：RReadnumij=Readnumij×{50 0/R e a dn um，将目标区域进行标准化，以--SEA/αα孕妇怀有--SEA/αα胎儿的作为基线，应用公式2：RReadnumij=Readnumij×R eadnumi/N]}，计算标准化值。

根据上述标准化值，应用贝叶斯模型，公式3：PFn（A/Rationm）=[PFn（Ratiom/A）PFn（Ratiom/A）×PF（nRatiom/B）×PF（nRatiom/C）×PF（nC）]（Fetal fractiom∈Fn），计算胎儿为三种不同基因型（αα/αα，--SEA/αα，--/--）的P值，最终根据P值来判断胎儿基因型。

2 结果

本研究中一共纳入22个家系，其中19个家系中夫妇双方α-地贫基因型均为--SEA/αα，2个家系中一方为-α3.7携带者，1个家系为点突变αQS携带者。夫妇双方为--SEA/αα的家系中，按照孟德尔定律，其胎儿将有25%可能性患巴氏胎儿水肿综合征。

应用本研究中的方法，依据贝叶斯模型的P值，可以通过无创产前检测的方法清楚判断出胎儿为三种基因型（αα/αα，--SEA/αα，--/--），当胎儿为其中基因型时，另外两种基因型的P值则明显降低。通过与产前诊断结果进行对比，本研究中无创产前检测对胎儿地贫基因中所有缺失型的判断，均与产前诊断结果保持一致，见表1。

除了能够准确判断胎儿缺失型α-地贫的基因型外，本研究中还发现可以准确判断出父源的地贫点突变型。如家系21中，丈夫携带点突变αQS，而在无创产前检测数据中，αQS对应位点的测序深度为198X，且100%均为野生型，可以推断此胎儿不携带父源突变。如家系22中，父方携带βCD37/β0，母方携带βCD41-42/β0，而无创产前检测结果提示，βCD37测序深度为268X，而全部均为野生型，推断此胎儿不携带父源突变，若无创产前检测结果提示，家系22不会生出重型地贫胎儿，可无需进行产前诊断。

3 讨论

孕期并发症在携带巴氏水肿胎的孕妇中是很常见。羊水过多和早产经常发生，其报告发病率分别高达29%和66%［15］。另一个与胎儿水肿相关的母体风险是镜像综合征，这是一种罕见但严重的疾病。Braun等［16］在文献回顾中指出，在56例镜像综合征患者中，母亲的主要发病率为肺水肿，占21%。重度先兆子痫有30%会发生母亲与水肿胎儿共存。产前诊断是早期发现这种疾病风险的必要条件，可以通过有创性胎儿取样或连续超声检测受累胎儿，然后进行有创性检测。而自从在母体血浆中发现cff-DNA以来，cff-DNA已被广泛应用，有望通过母体血浆中的胎儿DNA来无创性的检测出这类疾病。

目前，利用cffDNA进行地贫基因检测的研究仍不多［17-18］。Ge等［19］对5对SEA缺失的杂合子α-地中海贫血父母进行了384种不同条形码的靶区捕获测序。以母体血浆相对拷贝率为指标，结合R-score和L-score分析，与正常对照组比较，实现了估计胎儿基因型信号。Wang等［20］对2个家族采用靶向捕获测序和单倍型辅助分析方法，对东南亚缺失型α地中海贫血基因突变进行了无创性产前诊断。同时，也有团队应用Taqman实时定量聚合酶链反应（PCR）和荧光定量PCR检测孕妇血浆进行无创性检测［21］。上述这些方法可以检测或排除胎儿中不同于母体基因组的父系遗传突变，或者评估相对突变剂量或相对单倍型剂量，最终实现胎儿地贫基因的无创性判读。前面提到的研究已经证明了用cffDNA筛查Bart胎儿水肿的潜力。

而本研究中，我们提出了一种基于目标区域捕获结合高通量测序的方法，可无创性地判断胎儿患巴氏水肿综合征的概率。巴氏胎儿水肿综合征是由α-地贫基因同源20 kb纯合缺失导致的。由于怀有Bart水肿胎的孕妇的等位基因本身是杂合子，她携带野生型等位基因和SEA缺失型等位基因的数量相等。从巴氏水肿胎传给母体血浆的胎儿DNA仅含有SEA等位基因，会导致母体血浆中SEA等位基因总量增加，因此我们通过建立贝叶斯模型，可以根据读取计数确定胎儿基因型。由于不同胎儿基因型对计数变化微小，我们通过一组2 088个高变异性SNP作为质控，可以实现胎儿计数精确量化。结果表明，胎儿基因型的最终确定由胎儿分数和基于贝叶斯模型的计数统计组成，在所有22个家系中，均与产前诊断结果完全吻合，具有很高的准确性。因此，有望通过本研究中的方法对巴氏胎儿水肿综合征进行无创性地产前检测，实现避免侵入性操作分析α-珠蛋白基因和排除连续超声检查，更重要的一点，由于胎儿游离DNA在6周的时候就可以在母体血浆中发现，理论上，无创性地产前检测可以在妊娠6周进行，早发现，早诊断。此外，本研究中还发现无创性产前检测通过高深度的测序结果，可以轻松排除与母体不同的父源点突变。

综上所述，我们有理由相信无创性产前检测地贫基因，可以在判断缺失型α地贫导致巴氏胎儿水肿综合征，以及判断夫妇双方携带不同型地贫基因时，起到非常重要的作用，在孕早期获得结果，避免非必要的侵入式取样。减轻孕妇心理压力，符合临床要求。