胆固醇酰基转移酶-1在泛癌中的预测作用

戴龙飞，王 旭，柏 涛，陈 博，杨文奇

安徽医科大学第一附属医院普外科，安徽 合肥 230032

胆固醇酰基转移酶-1（acyl-coenzyme A:cholesterolacyltransferase-1，ACAT1）是一种将胆固醇转换为胆固醇酯的酶，可导致Warburg效应和肿瘤生长[1-2]。通过抑制ACAT1表达可增强T细胞效应器功能[3]。早有研究[4-6]表明，ACAT1表达水平与大多数肿瘤预后相关。这些发现提示，ACAT1可能是泛癌患者潜在的预后标志物。

肿瘤微环境是一个复杂的生态系统，存在于肿瘤发生发展的各个阶段[7]。许多“癌症标志”都与肿瘤微环境有关，包括诱导增殖和抑制细胞凋亡、抑制免疫系统避免免疫监测以及激活免疫细胞等[8]。在肿瘤微环境中鉴定治疗靶标可用于治疗癌症[9]。肿瘤细胞通过激活免疫检查点通路逃避免疫监视，而免疫检查点抑制剂可恢复抗肿瘤免疫反应[10]。肿瘤新抗原具有高度免疫原性，可激活T细胞产生免疫反应，影响免疫检查点抑制剂的疗效[11]。错配修复机制、肿瘤突变负荷和微卫星不稳定性相互关联，与免疫检查点抑制剂的敏感性有关，可以用于预测免疫检查点抑制剂的治疗效果[12-15]。DNA甲基转移酶抑制剂，可诱导T细胞吸引并增强免疫检查点抑制剂的功效[16]。

这项研究中，我们分析了ACAT1基因在泛癌患者中的预后及免疫作用。通过TCGA及GTEX数据库下载泛癌患者的基因表达数据、突变数据和临床生存数据，通过K-M生存分析探讨ACAT1基因在泛癌中的预后价值。利用TIMER数据库，研究ACAT1基因与肿瘤免疫浸润的关系，尤其是膀胱尿路上皮癌（bladder urothelial carcinoma，BLCA）和肾透明细胞癌（kidney renal clear cell carcinoma，KIRC）。最后，运用SangerBox分析ACAT1基因与免疫治疗的预测标志物（包括肿瘤新抗原、肿瘤突变负荷、微卫星不稳定性、错配修复缺陷、DNA甲基转移酶）之间的关系。本研究的发现揭示了ACAT1基因在泛癌预后和免疫浸润中的重要作用。

1 材料与方法

1.1材料

通过TCGA及GTEX数据库下载泛癌患者的基因表达数据、突变数据和临床生存数据。

1.2 方法

1.2.1 K-M生存分析 绘制Kaplan-Meier曲线分析泛癌中ACAT1基因表达水平与生存率的关系，包括总生存率（overall survival，OS），疾病特异生存率（disease free survival，DSS），无病生存率（disease-free interval，DFI）和无进展生存率（progression free survival，PFI）。阈值设置为Cox P值＜0.05。探讨ACAT1基因表达水平对泛癌的OS、DSS、DFI和PFI的影响。在急性髓系白血病（acute myeloid leukemia，LAML）、嗜铬细胞瘤和副神经节瘤（pheochromocytoma and paraganglioma，PCPG）、结肠腺癌（colon adenocarcinoma，COAD）、BLCA、头颈鳞状细胞癌（head and neck squamous cell carcinoma，HNSC）、肺腺癌（lung adenocarcinoma，LUAD）、肝细胞癌（liver hepatocellular carcinoma，LIHC）、直肠癌（Rectum adenocarcinoma，READ）、KIRC、肾乳头状细胞癌（kidney renal papillary cell carcinoma，KIRP）和脑低级别胶质瘤（brain lower grade glioma，LGG）中分析ACAT1基因表达与OS、DSS、DFI和PFI的相关性。计算95%CI的危险比（HR）和对数秩P值。

1.2.2 TIMER中ACAT1表达与泛癌免疫浸润的关系 TIMER是一个全面的资源数据库，用于系统分析不同癌症类型的免疫浸润。用TIMER数据库测定ACAT1基因表达与免疫浸润的关系，是系统分析不同癌症类型免疫浸润的理想资源。TIMER应用统计反褶积方法，从基因表达谱推断肿瘤浸润免疫细胞的丰度。TIMER数据库包含了来自TCGA的32种癌症类型的10 897个样本，用于评估免疫浸润的丰度。从TIMER数据库中下载泛癌的6种免疫浸润细胞的得分数据，分析基因表达与免疫细胞得分的相关性。分析ACAT1基因的表达与6种免疫浸润细胞之间的关系，包括B细胞、CD4+T细胞、CD8+T细胞、中性粒细胞、巨噬细胞和树突状细胞。使用R软件包estimate分析各个肿瘤样本的免疫评分和基质评分，同时测定ACAT1基因的表达水平与肿瘤纯度的关系。

1.2.3 Sanger Box Sanger Box工具盒（http://sangerbox.com/）是一款具有多种生物信息分析，可视化作图和便捷数据下载功能的工具。本研究收集了常见的四十多个免疫检查点基因，利用Sanger Box分析ACAT1基因表达与免疫检查点基因的关系，同时分别提取这些免疫检查点基因，计算与ACAT1基因表达水平的相关性。此外，本研究还利用Sanger Box分析了ACAT1基因与泛癌患者免疫检查点抑制剂的预测标志物（包括肿瘤新抗原、肿瘤突变负荷、微卫星不稳定性、错配修复基因突变、DNA甲基转移酶）的相关性。

1.2.4 统计学方法 利用Kaplan-Meier生存曲线探讨ACAT1表达水平与泛癌的预后的关系。此外，利用Sanger Box分析ACAT1基因表达与免疫治疗的预测标志物之间的关系。基因表达的相关性采用Spearman相关分析。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 ACAT1基因在肿瘤组织和正常组织中的差异表达

通过收集TCGA及GTEX数据库中泛癌组织和正常组织的标本，分析ACAT1基因在不同肿瘤和邻近正常组织中的差异表达。结果显示：在大部分癌症中ACAT1基因表达水平明显低于邻近正常组织，而在多形性胶质母细胞瘤（glioblastomamultiforme，GBM）、脑低级别胶质瘤（brain lower grade glioma，LGG）和肾嫌色细胞癌（kidney Chromophobe，KICH）中明显高于临近正常组织，差异有统计学意义（P＜0.05），见表1。

表1 ACAT1基因在肿瘤组织和正常组织中的差异表达 个

2.2 ACAT1基因在泛癌中的预后分析

利用K-M生存分析进一步评估ACAT1基因与预后的关系。ACAT1基因低表达显著提高了HNSC的OS、DSS、DFI和PFI。ACAT1基因低表达显著提高了LAML的OS。在PCPG和COAD中，ACAT1基因低表达对其DFI具有保护作用。而在BLCA中，ACAT1基因低表达显著提高其OS和DSS，但是在KIRP患者中，低ACAT1基因表达对其OS和DSS不利。另外，ACAT1基因显著降低了READ中的PFI。在KIRC和LGG中，ACAT1基因对OS、DSS和PFI均不利。最后研究还发现，ACAT1基因低表达显著降低了LUAD的DSS和PFI。考虑到以上结果中HR值仅为0.98，0.99和1.02等，我们对以上肿瘤的ACAT1表达量进行log2转换，转换后发现，差异有统计学意义（P＜0.05），见表2。

表2 ACAT1基因在泛癌中的预后分析

2.3 ACAT1基因与免疫浸润的关系

本研究进一步评估了泛癌中ACAT1基因表达与免疫浸润水平的相关性，确定不同肿瘤组织中ACAT1基因的表达是否与6种免疫浸润细胞（B细胞、CD4+T细胞、CD8+T细胞、中性粒细胞、巨噬细胞和树突状细胞）相关。结果显示：与免疫浸润细胞最显著相关的3种肿瘤分别为BLCA、LGG和肉瘤（sarcoma，SARC）。

本研究还分析了在泛癌中ACAT1基因表达与免疫评分、基质评分和综合评分的关系。结果显示：与免疫评分最显著相关的为BLCA、甲状腺癌（thyroid carcinoma，THCA）和KIRC，与基质评分最显著相关为LIHC、THCA和KIRC，与综合评分最显著相关为胰腺癌（pancreatic adenocarcinoma，PAAD）、THCA和KIRC。基于以上发现，我们选择KIRC代表当ACAT1基因低表达水平时生存率低的癌症，而BLCA代表生存率良好的癌症。对于KIRC，ACAT1基因表达水平与免疫评分（R=-0.319,P=6.21e-14）呈显著负相关，而对于BLCA，与免疫评分（R=0.336，P=4.04e-12）呈显著正相关，并且与CD4+T细胞、 CD8+T细胞、巨噬细胞及中性粒细胞的浸润水平呈显著正相关。此外，KIRC中的ACAT1基因表达水平与肿瘤纯度呈正相关，而在BLCA中无相关性。这些发现有力地表明，在KIRC和BLCA中，ACAT1基因通过与免疫浸润相互作用而影响患者生存，见表3。

表3 ACAT1基因与免疫浸润的关系 分

另外，本研究还分析了ACAT1基因与免疫检查点基因的表达关系。在乳腺癌（breast invasive carcinoma，BRCA）、 LIHC、 KIRC、 THCA、 KIRP及LUAD中，ACAT1与免疫检查点基因显著负相关。

2.4 ACAT1基因表达水平与肿瘤新抗原、肿瘤突变负荷（tumormutationalburden，TMB）、微卫星不稳定性（microsatellite instability，MSI）的关系

本研究分析了ACAT1基因表达水平与肿瘤新抗原数量、TMB及MSI的关系。我们发现，在BRCA中，ACAT1基因表达水平与新抗原数量显著负相关（R=-0.133，P=0.000 31）；在BRCA中ACAT1基因表达水平与TMB显著负相关（-0.36＜R＜0，P=8.5e-13）,在PAAD中ACAT1基因表达水平与TMB显著负相关（-0.36＜R＜0，P=1.4e-06）；在BRCA中ACAT1基因表达水平与MSI显著负相关（-0.27＜R＜0，P=0.006 7）,在THCA中ACAT1基因表达水平与MSI显著负相关（-0.27＜R＜0，P=0.003 5）。

2.5 ACAT1基因表达水平与错配修复缺陷（different mismatch Repair，dMMR）及DNA甲基转移酶的关系

评估错配修复基因MLH1、MSH2、MSH6、PMS2及EPCAM突变与ACAT1表达的关系。结果表明，当ACAT1基因低表达时，LIHC错配修复基因的MSH2（-0.25＜R＜0，P＜0.001）及MSH6（-0.25＜R＜0，P＜0.05）突变率高，容易出现dMMR。

我们进一步分析了ACAT1表达与四个甲基转移酶（DNMT1，DNMT2，DNMT3A，DNMT3B）的关系。结果显示：ACAT1基因表达水平与LIHC中的甲基转移酶显著负相关，与葡萄膜黑色素瘤（Uveal Melanoma，UVM）及PAAD显著正相关，见表4。

表4 ACAT1基因表达水平与dMMR及DNA甲基转移酶的关系

3 讨论

ACAT1是CD8+T细胞中胆固醇酯化的主要酶，抑制ACAT1活性可显著增强CD8+T淋巴细胞的效应器功能，促进CD8+T细胞的增殖。这是由于CD8+T细胞质膜胆固醇水平的增加，增强了T细胞受体聚集和信号传递以及更有效地形成免疫突触[17]。这些证据表明，抑制ACAT1活性可提高机体的免疫力，同时为肿瘤的预后和免疫治疗提供新方向。

ACAT1基因被证实与多种癌症的增殖相关[18-20]。因此我们推测，ACAT1基因可能通过促进肿瘤细胞增殖影响患者的生存。与正常组织相比，ACAT1基因在大部分肿瘤组织中表达水平较低。在LAML、PCPG、COAD、BLCA、HNSC中，ACAT1基因低表达与较好的预后相关，而在LUAD、READ、KIRC、KIRP、LGG中预后较差。

BLCA和KIRC在免疫浸润和ACAT1基因表达之间的相关性方面有不同的模式，这些发现目前为止尚属首次。在BLCA和KIRC中，ACAT1基因表达具有不一致的预后价值。ACAT1基因低表达与BLCA的良好预后相关，而KIRC则相反，这与Chen L等[21]的研究结果一致。我们还发现ACAT1基因表达与免疫细胞浸润之间存在显著相关性，尤其在BLCA和KIRC中，ACAT1基因的表达与不同的免疫浸润水平相关。我们发现，ACAT1基因的表达与BLCA中免疫细胞评分显著正相关，而与KIRC显著负相关。BLCA的免疫浸润与ACAT1基因的表达水平呈正相关，而KIRC呈负相关。这一结果提示，ACAT1基因表达与某些免疫细胞标志物之间的关系并不总是与整体趋势相同，ACAT1与某些免疫细胞亚型之间可能具有某种特定的相互作用，这种特定的相互作用目前尚未可知，需要更多的研究去证实。更加有趣的是，在BLCA中ACAT1基因的表达水平与肿瘤的纯度无关，而在KIRC中与肿瘤纯度呈显著正相关。这一证据提示，ACAT1在BLCA肿瘤细胞和肿瘤微环境中同样表达，而仅在KIRC肿瘤细胞中相对富集，这种差异可能与肿瘤微环境中不同的ACAT1基因富集方式有关。作为重要的抗原提呈细胞，CD8+T细胞和巨噬细胞是BLCA中与ACAT1表达最显著相关的细胞类型，然而在KIRC中则不是。因此，我们推测肿瘤在向肿瘤微环境招募抗原提呈细胞时存在异质性，这一结果与Patente TA等[22]的研究结果相似。ACAT1基因在肿瘤中免疫浸润细胞的募集和调节中起着重要作用，最终可能影响患者的生存。

当免疫检查点基因高表达时，免疫检查点活跃，使抗原不能被提呈至T细胞，抑制T细胞的免疫功能，肿瘤得以逃脱生存。Hu F F等[23]的研究表明，在癌症样本中上调免疫检查点基因的数量越多，越适用于免疫治疗。我们发现，当ACAT1低表达时，BRCA、LIHC、KIRC、THCA、KIRP及LUAD中的免疫检查点基因显著高表达，这说明这些肿瘤适用于免疫治疗。研究表明，肿瘤新抗原数目多、高TMB、高微卫星不稳定性（microsatellite instability high， MSI-H）、错配修复缺陷及DNA甲基转移酶抑制，肿瘤免疫治疗效果越好。我们发现，当ACAT1基因低表达时：BRCA的新抗原数量多、高TMB、MSI-H，这与Bianchini G等[24]的研究结果一致；THCA患者具有MSI-H，这与Ferrari SM等[25]的研究结果一致；PAAD具有高TMB及DNA甲基转移酶受到抑制，Schizas D等[26]发现免疫治疗联合其他治疗可协同作用于PAAD； UVM的DNA甲基转移酶受到抑制，Heppt M V等[27]发现免疫检查点阻断联合CTLA-4和PD-1抑制是迄今为止UVM最有效的治疗方法；LIHC错配修复缺陷及DNA甲基转移酶高表达，错配修复基因高突变时可增强免疫检查点抑制剂疗效，而DNA甲基转移酶活性强时会降低免疫检查点抑制剂疗效，这说明免疫治疗仅对某些LIHC患者有益，免疫治疗在LIHC中的免疫反应差异很大，这一现象可能与以下原因有关，Cao D等[28]发现LIHC患者的预后与T细胞浸润的免疫表型（CD8表达）和适应性免疫抵抗基因（B7-H3或CD47）的表达有关，B7-H3患者低/CD8高或CD47低/CD8高的存活率最高，而B7-H3高/CD8低或CD47高/CD8低的存活率最差。

综上所述，BRCA、LIHC、KIRC、THCA、KIRP、LUAD、PAAD及UVM的免疫治疗效果好，而ACAT1基因低表达可作为泛癌的免疫治疗预测标志物。