DNA分子标记在竹类植物中的应用进展

叶媛丽，吴章桥，何欣，王东博，孙杰，朱晓霞

（1 西南科技大学生命科学与工程学院，四川绵阳 621010；2 四川省生物质资源利用与改性工程技术研究中心，四川绵阳 621010）

竹属禾本科竹亚科植物，广泛分布在热带、亚热带地区，温带和寒带地区也有少量分布[1]。我国是竹类资源最丰富的国家，在北起辽宁、南到海南的领土上分布着大面积的竹类植物。据不完全统计，全世界共有127属约1680 种竹类植物，其中中国特有竹类植物23 属371 种[2]，约占22%。大多数植物产生巨大经济效益几乎都是通过新品种持续选育来实现的，传统的形态学方法在亲缘关系鉴定、遗传多样性探索等方面准确性较低，且对数量性状的鉴定具有一定的局限性，使植物新品种创制受到限制。因此，DNA 分子标记技术应运而生。DNA 分子标记是根据个体或种群间的核苷酸序列的差异作为遗传标记，直观明了地从DNA 水平上反映出生物的多样性[3]。随着分子生物学的不断发展和完善，到21 世纪初，DNA 分子标记技术已在水稻、玉米、小麦等多种禾本科植物的遗传多样性研究、分子遗传图谱与指纹图谱构建等研究中得到成功应用。

1 DNA 分子标记的类型和特点

分子标记是根据个体或种群间的核苷酸序列的差异作为遗传标记，直观明了地从DNA 水平上反映出生物的多样性。与传统的形态学标记、细胞标记、生物化学标记相比，分子标记更具优势，主要表现在以下几个方面[4-5]：①存在形式为DNA，在生物的各组织、各发育阶段都可进行标记分析；②具有区分显性纯合以及杂合体的功能；③不仅标记的类型丰富多样，而且仅用简单高效手段就可将其检测出来。目前，分子标记主要分为3 类[6]：以杂交为基础的分子标记，主要是限制性片段长度多态性（RFLP）；以PCR 为基础的分子标记，主要是随机扩增多态性（RAPD）、简单重复序列（SSR）、扩增片段长度多态性（AFLP）、内部简单重复序列（ISSR）；以单核苷酸变异为基础的分子标记，主要包括单核苷酸多态性（SNP）。接下来对几种常用的分子标记技术进行介绍。

1.1 AFLP 分子标记

AFLP 分子标记利用PCR 技术扩增基因组DNA片段，基因组DNA 首先需要用限制性内切酶切割，接着将双链的接头与DNA 片段的末端相连，其引物由接头、酶切位点和几个核苷酸组成[7]。在PCR 扩增时，引物与接头特异性识别，扩增出片段大小不一的DNA 片段。但此项技术成本相对较高，对所用DNA 的纯度也有一定的要求。

1.2 SSR 分子标记

SSR 分子标记是利用微卫星DNA 两端的重复序列具有相对保守的单拷贝序列的特点来设计引物，利用此引物扩增出串联重复序列，再通过电泳分析技术获得其DNA 的长度多态性。所谓的微卫星DNA 就是指分布在整个基因组的不同位置、以1～6 个核苷酸为基本单位组成的串联重复序列，是SSR 分子标记技术的基础[8]。该分子标记方法具有较好的重复性和可靠性。

1.3 ISSR 分子标记

ISSR 分子标记是针对SSR 的局限性而开发的，该技术不需要预先知道目标基因的序列就可以扩增出序列相同、方向相反的基因片段。与SSR 相比，ISSR 成本更低、操作也更加简单，加之其所用的引物较长，实验也具有较高的重复性[9]。

1.4 RAPD 分子标记

RAPD 分子标记利用由8～10 个碱基组成随机引物，通过非定点扩增DNA 片段，接着凝胶电泳成像，利用条带结果进行DNA 片段的多态性分析，根据片段多态性来推测该种生物内DNA 的多态性和表型性状的规律。该技术也不需要预先知道DNA 的序列，DNA 的用量少、反应灵敏[10]。但是该技术在区分纯合子和杂合子方面具有一定的困难，且其重复性和稳定性都比较差。

1.5 SCoT 分子标记

SCoT 分子标记是2009 年由Collard 和Mackill 共同开发的一种新的分子标记技术，根据植物基因中以ATG 翻译起始位点的侧翼序列的保守性，设计出可同时充当上下游的单引物，并对生物基因组进行扩增[11]。SCoT 有效地产生与性状连锁的标记，可有效避免获得的多态性位点与目标性状基因相隔太远。

2 DNA 分子标记在竹类植物中的应用

2.1 指纹图谱构建

个体在DNA 水平上的差异可由指纹图谱直观明了地体现出来[12]，因此，可以对竹种的分子遗传图谱作图，构建出竹类植物的DNA 多态性，筛选出能够反映竹种或品种特征的指纹图谱作为竹类植物分类与鉴定的分子依据。袁金玲等[13]发现SSR 引物能有效地鉴定丛生竹杂交种，并且利用SSR 引物扩增出来的位点可以构建2 个杂交群体的指纹图谱，为该品种的保护提供了保障。瞿印权等[14]为研究绿竹等30 个竹种的亲缘关系，基于ISSR 标记建立其DNA 指纹图谱，结果表明ISSR 技术可准确地分析竹种间的亲缘关系。

2.2 遗传多样性分析

遗传多样性是指某个物种或群体内部的个体间的遗传变异的总称。对于分布较广的竹类植物来说，地理因素对其天然居群的物种分化具有深远的影响，但在两者的相关性上，不同物种的研究结果并不一致。刘济明等[15]利用RAPD 标记发现小生境间的差异使小蓬竹具有较高的遗传多样性。同年该学者仍采用RAPD 标记技术欲从分子水平上研究不同居群小蓬竹的遗传多样性和环境因子的相关性，结果发现，主要的遗传变异存在于小蓬竹居群内部而非各个天然的居群之间，同时小蓬竹居群内部多样性最丰富的是落湾，这可能与采样地前一年遭遇了大旱有关[16]。复合体内各竹种间的划分由于形态学特征上存在着不同程度的过渡而变得十分困难。黄蕾等[17]对箭竹复合体内不同居群的SSR 数据进行分析发现：海拔和纬度对箭竹复合体内遗传多样性虽有一定的影响，但并非二者直接导致，而是多种进化因素的共同作用。李世添[18]率先尝试利用IRAP 分子标记技术分析刚竹属植物的种间遗传多样性，同时也为竹类植物的鉴别提供新思路。董文渊等[19]对筇竹11 项形态性状进行分析研究，结果显示，10 项性状在居群间差异达到了极显著水平，从形态水平上揭示了10 个筇竹自然居群间丰富的遗传多样性。之后邱月群等[20]基于SSR 技术进行同样的研究，却发现筇竹居群遗传多样性呈现中等水平，且遗传变异主要存在于居群内，这与之前基于形态学的研究结果有一定的出入。

2.3 亲缘关系鉴定及分析

大多数竹类植物采用无性繁殖，其品种及栽培类型如果只靠传统的形态学鉴定是不准确的，导致许多竹种之间亲缘关系还存在一定的争议，这直接影响了竹类植物科学有效地利用。从分子上对亲缘关系进行鉴定，比传统的形态学鉴定更加准确。徐鹏飞[21]首次筛选出15 对适用于TP-M13-SSR 荧光毛细电泳检测的引物，并利用此项技术鉴定疑似杂交种。赵琳[22]采用ISSR 对3 个属11 个耐湿竹种进行亲缘关系的研究，利用此分子标记技术可明显地将11 个竹种区分开来，同时聚类分析结果与部分传统形态学鉴定结果一致，在一定程度上支持并补充了传统的形态学分类方法。

3 展望

分子标记目前已广泛应用于多种竹类植物，并已建立其特定分子标记反应体系，为后续分析奠定了基础。DNA 分子标记大多用于竹类植物遗传多样性研究，而在亲缘关系鉴定以及指纹图谱构建方面研究相对较少，导致近缘种或野生种难以得到科学利用，分子标记辅助选择育种的开展受到一定的制约。为此，今后应加强竹类植物DNA 分子标记技术在以下3 个方面的利用：一是加强DNA 分子标记技术在竹类植物指纹图谱构建、种质资源鉴定方面的应用；二是构建不同竹类植物高密度的分子连锁遗传图谱，寻找出与目标性状紧密连锁的分子标记；三是DNA 分子标记应用于竹类植物分子辅助育种和对突变体的鉴定。

（收稿：2022-02-17）