蘑菇源凝集素的活性及应用

张相锋

（伊犁师范大学/伊犁师范大学微生物资源保护与开发利用重点实验室，新疆伊宁 835000）

1 凝集素概述

凝集素（lectins）是一种能够凝集细胞、特异性结合碳水化合物的蛋白质或者糖蛋白，在许多领域表现出重要的应用价值[1]。凝集素通过与细胞表面单糖或寡糖独特结合能力导致各种细胞类型的凝集。凝集素的碳水化合物结合位点与存在于细胞表面的聚糖相互作用。因此，凝集素能够与各种糖复合物相互作用，并作为检查细胞生理和病理的工具。凝集素在自然界中分布十分广泛，包括微生物凝集素、植物凝集素和动物凝集素。细菌、藻类、原生动物、地衣、病毒、酵母、担子菌和放线菌中的微生物凝集素已被广泛鉴定，并参与了多种细胞-细胞相互作用。在真菌中，凝集素在曲霉菌属、头孢菌属、镰刀菌属、青霉菌属、根孢菌属和菌核属中得到广泛研究[2]。

近年来，不同来源的凝集素得到广泛研究，越来越多的证据表明它们在生物医学领域具有巨大的应用潜力[3]。它们通过诱发自噬和凋亡来抑制癌细胞，最终导致细胞死亡[4]。凝集素通过诱导各种免疫刺激活性，成为癌症治疗的潜在治疗药物，并表现出临床意义。各种来源的微生物凝集素在诊断试剂、生物絮凝、益生菌和药物靶向制剂[5]等方面都有潜在的应用价值。现主要介绍蘑菇凝集素的来源、特性及其在生物医学研究中的应用。

2 蘑菇凝集素的来源及其凝集活性

真菌是新型凝集素的潜在来源，这些凝集素对一些多糖具有特异结合能力，在生物技术和临床治疗方面具有潜在的应用价值[6]。据报道，大约80%的真菌凝集素是从蘑菇中分离出来的[7]，其中相当一部分凝集素来自于食用菌[8-13]。在担子菌中，有大量凝集素的报道，包括牛肝菌属、乳菇属、鬼笔属、红菇属以及蜡伞科和口蘑科[14]。最近，有蘑菇凝集素已经从红菇科被开发出来，特别是脆褶属和乳菇属2 个属[15]。凝集素广泛分布于蘑菇的子实体和营养菌丝中，研究人员从担子菌中分离出了各种细胞内、细胞外和菌丝表面凝集素[16]。

用红细胞进行凝集试验，可测定凝集素的凝集度。Singh 等[17]已经大量报道了蘑菇凝集素的凝集模式。与人红细胞相比，蘑菇凝集素在动物红细胞中表现出优先的凝集活性[18]。因此，蘑菇凝集素可以区分人红细胞和动物红细胞，也可以区分不同动物的红细胞。

3 蘑菇凝集素的特性

蘑菇凝集素在不同的pH 值和温度范围内表现出不同理化特性，包括碳水化合物含量、分子量、亚基数目和稳定性。各种色谱技术已被用于蘑菇凝集素的纯化。基于凝集素对碳水化合物专一性的亲和层析方法，已被广泛应用于真菌凝集素的纯化。最近，人们通过亲和层析法纯化了各种蘑菇凝集素，其亲和吸附剂包括BSM（bovine submaxillary mucin）-Toyopearl、嵌入红细胞基质的聚丙烯酰胺、琼脂糖和几丁质琼脂糖。近年来，通过离子交换色谱法和凝胶渗透色谱法纯化了一些蘑菇凝集素[9]。研究发现，离子交换层析、亲和层析和凝胶渗透色谱等方法对蘑菇凝集素的纯化具有较高收率，其中亲和层析作为一种单步纯化方法或与其他技术相结合，是纯化凝集素的首选方法。

蘑菇凝集素的分子量在12-190 kDa 之间，由2 个或2 个以上亚基组成。在蘑菇中，翘鳞环锈伞凝集素的分子质量最低，约为4.5 kDa。根据Hassan 等[19]的研究，蘑菇凝集素的晶体结构可分为“螺旋状”褶皱、“半乳糖蛋白样”褶皱、“卷曲三叶状”褶皱和“动蛋白孔蛋白样”褶皱。蘑菇凝集素在中等温度下通常是稳定的，在较高温度下则失去活性。虽然红菇凝集素在高温下表现出一定的热稳定性，但它们对pH 值的变化非常敏感，即使是微小变化也会导致凝集素活性完全丧失[20]。

Singh 等[2]和Hassan 等[21]对蘑菇凝集素的碳水化合物特异性进行广泛的综述。蘑菇凝集素对N-乙酰氨基葡萄糖（GlcNAc）表现出特异性，可作为O-连接N-乙酰氨基葡萄糖胺修饰蛋白分析的潜在工具[22]。岩藻糖特异性凝集素可作为癌细胞的潜在生物标记物被开发[23]。粘蛋白型O-聚糖特异性凝集素可作为疾病的生物标志物，参与细胞表面功能[8]。因此，凝集素基于其对碳水化合物结合的特异性，可以作为潜在的诊断试剂，用于分析与细胞表面相关的各种生物学功能。

4 蘑菇凝集素的生物活性及应用

多年来，研究人员对蘑菇凝集素生物学活性进行了广泛的研究。Hassan 等[19]对数百种蘑菇凝集素的分子、生化和结构特征及其潜在应用进行广泛综述。基于凝集素-聚糖的相互作用，蘑菇凝集素已被报道在治疗中显示出强大的抗病毒活性、有丝分裂原性、免疫调节活性[3]。关于蘑菇凝集素在抗增殖活性、免疫调节活性、抗菌、抗氧化作用方面有大量报道。

4.1 抗肿瘤作用

蘑菇凝集素对各种类型的癌症如肉瘤、肝癌、白血病具有抑制作用。由于凝集素对糖类的专一性，它们与癌细胞表面发生变异的聚糖相互作用，这有助于抑制癌细胞的增殖[24]。癌细胞表面改变可能是其糖基化单位或唾液酸含量的改变[25]。凝集素与癌细胞相互作用后，诱导各种免疫调节活性，抑制细胞增殖，导致细胞死亡[25]。蘑菇凝集素对表达大量乙酰氨基葡萄糖胺残基的人结肠癌（HT29）表现出强大的抗增殖作用[26]。乙酰氨基葡萄糖胺特异性的蘑菇凝集素可以作为一种潜在的工具，用于标记癌症或其他病变细胞上截短的聚糖。它们能将癌细胞阻滞在G2/M 细胞周期阶段，抑制细胞增殖[26]。

蘑菇凝集素作为一种显著的抗增殖剂，可在恶性增殖条件下发挥潜在的治疗作用。在蘑菇中，茶树菇凝集素（AAL 和AAL-2）对各种癌细胞系如乳腺癌、结肠癌、胃癌、肝癌和肉瘤表现出抗肿瘤活性。在乳腺癌中，富含透明质酸的间质非常显著。透明质酸是由D-葡萄糖醛酸及N-乙酰葡糖胺组成的双糖单位组成的多糖[28]。茶树菇凝集素在体内与乳腺癌（4T1）细胞的透明质酸相互作用，以caspase-3/7 依赖的方式诱导细胞凋亡，从而表现出抗转移活性[4]。

研究人员发现双孢菇、牛肝菌、黄伞和硬柄小皮伞的蘑菇凝集素都显示出对结肠癌细胞系的细胞毒活性。在结肠癌组织中，Gal 末端残基C-3 位置的硫酸化作用降低，因此唾液酸聚糖表达增强[28]。这些聚糖可以作为各种凝集素的潜在结合位点，发挥抗增殖活性。黄蜜环菌凝集素抑制白血病（MBL2 和L1210）和宫颈癌（HeLa）细胞系[29]。蘑菇凝集素还能有效抑制小鼠淋巴细胞白血病细胞的增殖。在白血病、甲状腺、结直肠癌、脑癌和乳腺癌中病变细胞存在着α-L 岩藻糖突变[30]。这些改变赋予相应癌细胞表面的寡糖一定的特异性，成为一些蘑菇凝集素的特异识别位点，从而诱发细胞凋亡或抑制癌细胞迁移。

宽鳞多孔菌凝集素对哺乳动物癌细胞具有抗增殖作用。宽鳞多孔菌凝集素抑制细胞蛋白质的合成，从而诱导细胞凋亡[31]。然而，硬柄小皮伞凝集素对哺乳动物癌细胞的细胞毒性仅部分依赖于其蛋白水解活性[32]。双孢菇凝集素对结肠癌细胞株具有抗增殖作用[33]。蘑菇凝集素在体外和体内都能通过调节免疫系统抑制癌细胞增殖[34]。因此，蘑菇凝集素利用对糖的特异性，通过免疫调节作用、诱导细胞凋亡或交联肿瘤细胞表面聚糖等方式，发挥对癌细胞抗增殖活性。蘑菇凝集素对癌细胞具有抗增殖作用，可以作为诊断和实验分析的潜在工具，研究细胞生长、细胞反应和分化的不同特征。蘑菇凝集素具有良好的抗肿瘤活性，是一种有前景的抗肿瘤药物。

4.2 促细胞分裂作用

蘑菇凝集素对脾脏细胞和淋巴细胞具有较高的有丝分裂原性，可刺激细胞（淋巴细胞/脾细胞）从小的静止细胞向大的胚状细胞转化[35]。魔牛肝菌凝集素在较低浓度条件就能对人类淋巴细胞表现出显著的细胞分裂原活性[36]。魔牛肝菌凝集素与其他凝集素相比，在诱导人类淋巴细胞增殖能力上约高200 倍[37]。研究还发现，草菇、香菇、金针菇、蛹虫草、猴头菇凝集素均有分裂原活性。

凝集素通过与特定的细胞表面多糖识别结合，诱导一系列膜性改变，触发细胞内级联，促进细胞进行有丝分裂。当细胞受到有丝分裂因子的刺激，通过诱导细胞内一系列信号传导通路由不活跃状态转变为活跃状态，进而引起细胞进行分裂。通过凝集素-聚糖相互作用，蘑菇凝集素可激活T 细胞通过钙-钙调神经磷酸酶-核因子信号通路诱导有丝分裂，导致细胞增殖[38]。蘑菇凝集素的有丝分裂活性也可以通过激活InSP3 离子醇受体或钙依赖性蛋白激酶来实现[39]。少数蘑菇凝集素通过p56lck 依赖的激活途径诱导有丝分裂，导致淋巴细胞的激活和增殖[40]。

4.3 免疫调节作用

蘑菇中的真菌免疫调节蛋白能够刺激小鼠脾脏中的单核细胞、淋巴细胞和巨噬细胞增殖[41]。它们能够增加Ⅰ型T 辅助细胞（Th-1）产生的细胞因子，从而抑制过敏反应。最近有报道称，硫磺菌凝集素可与Toll 样受体-4（Toll-like receptor4,TLR-4）相互作用，刺激巨噬细胞产生一氧化氮、细胞因子和肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor,TNF）。一氧化氮（nitric oxide,NO）是炎症反应过程中的重要介质和调节因子，它可诱导机体杀灭侵入的病原微生物，维持正常的免疫防御功能。肿瘤坏死因子-α（Tumor necrosis factor-α，TNF-α）在细胞炎症、凋亡、增殖和分化中发挥重要作用。具有免疫调节功能的凝集素可显著增加细胞因子的分泌，帮助有机体抵抗各种病原体侵害。

蘑菇凝集素主要通过巨噬细胞参与调节免疫应答。巨噬细胞是一种重要的免疫细胞，它具有自噬和异噬功能，主要在肿瘤、感染和炎症等刺激因素作用下发挥作用。凝集素与细胞表面受体（如toll 样受体）结合，触发多条下游信号通路，激活巨噬细胞，产生一氧化氮、一氧化氮合酶、白细胞介素因子（IL-6、IL-1-IL-1 IL-1 IL-1、IL-10）和肿瘤坏死因子，调节免疫细胞并产生免疫反应。白细胞介素（IL-2）和干扰素（IFN--γ）是由Ⅰ型T 辅助细胞（Th1）产生的，这些细胞因子上调是由凝集素亚群T 细胞增殖产生的。蘑菇凝集素通过细胞因子的调节和增殖发挥免疫调节作用。

凝集素的免疫调节机制主要涉及到凝集素与靶细胞上多糖之间特异性的识别结合。这种识别机制导致了下游信号传导和巨噬细胞的活化，从而诱导各种细胞因子的分泌和一氧化氮的产生。基于凝集素的相互作用，可以帮助我们认识免疫反应机制。因此，凝集素可以作为候选药物，应用各种免疫相关疾病病理的认识和治疗。

4.4 抗病毒活性

蘑菇凝集素已被人们广泛地应用于抗病毒领域的研究。

4.4.1 抗人类免疫缺陷病毒（HIV）。HIV 逆转录酶（HIV-RT）是HIV 生命周期中的关键酶。当HIV 被CD4 细胞吞噬时，HIV-rt 将其RNA 转化为互补DNA，这是HIV 疾病建立的关键步骤。在蘑菇凝集素中，金顶侧耳、裂褶菌、黄伞、大肥蘑菇和茶褐丝盖伞凝集素均表现出抗HIV 逆转录酶活性，其中以金顶侧耳凝集素抗HIV 逆转录酶活性最强，因为试验数据显示其有最低的IC50 浓度[42]。根据HIV-RT 抑制剂作用模式，可以分为核苷类和非核苷类HIV-RT 抑制剂。核苷HIV-RT 抑制剂的作用机制是直接整合到病毒DNA中，而非核苷HIV-RT 抑制剂直接与酶（逆转录酶）结合。因凝集素对HIV-RT 具有特异结合和抑制能力，从而成为了抗HIV 药物研究的热点。

4.4.2 抗乙型肝炎病毒（HBV）。乙型肝炎病毒是一种部分双链DNA 病毒，属于正嗜肝病毒属。可引起慢性肝炎、肝硬化等严重感染，对全球公共卫生问题构成威胁。平菇凝集素有可能激活HBV 特异性T 细胞应答[42]。平菇凝集素上调Toll 样受体-6（Toll-like receptor6,TLR-4）及相关信号分子和IL-1 蛋白的表达，从而刺激树突状细胞Toll 样受体-6 信号通路，激活先天性免疫应答[42]。平菇凝集素刺激IL-21 的产生，IL-21又激活TfH 细胞，进而促进体液免疫。因此，平菇凝集素可作为治疗慢性HBV 感染的潜在候选药物[42]。

4.4.3 抗白斑综合征病毒（WSSV）。白斑综合征病毒是一种双链包膜DNA 病毒，是引起虾类致命病毒性疾病的主要病原体。重组茶树菇凝集素（AAL-His）对白斑综合征病毒表现出抗病毒活性[42]。茶树菇凝集素（lectin-His）与WSSV 病毒粒子结合，并直接与4 种WSSV 结构蛋白相互作用，发挥其抗病毒活性。通过杂交筛选、蛋白体外结合实验和免疫共沉淀实验发现，茶树菇凝集素与VP39B、VP41B、VP53A-N 和VP216-N 4 种WSSV 结构蛋白具有强烈的相互作用[42]。由于蛋白-蛋白的相互作用参与了病毒的感染，因此，凝集素可以作为一种抗WSSV 病毒感染的制剂加以开发利用。

4.5 抗微生物活性

一些研究中蘑菇凝集素也表现出了抗细菌和真菌活性。研究人员正在研究利用凝集素对致病分枝杆菌种类进行鉴别，及其对临床中重要致病细菌的抑制作用。桔黄裸伞凝集素在体外培养条件下，对革兰氏阳性细菌金黄色葡萄球菌有抑制作用[43]。革兰氏阳性菌的细胞壁由磷壁酸、肽聚糖（N-乙酰氨基葡萄糖和N-乙酰壁酸残基构成）和其他表面蛋白组成。橘黄裸伞凝集素对n-乙酰氨基葡萄糖具有特异性[44]。因此，橘黄裸伞凝集素对金黄色葡萄球菌的抗菌作用可能是由于橘黄裸伞凝集素与细菌细胞壁残基的相互作用所致。广叶绣球菌凝集素具有广谱抗菌潜力，但对革兰氏阴性菌的抑制活性高于革兰氏阳性菌[45]。脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）是革兰氏阴性细菌细胞壁最外层的一层较厚的类脂多糖类物质，其多糖部分能作为抗原，诱发相应的免疫反应，也是凝集素特异识别结合的位点。广叶绣球菌凝集素与革兰氏阴性菌的脂多糖相互作用后，圆二色谱（CD spectroscopy）光谱学显示凝集素结构由随机螺旋转变为梭状-螺旋状构象，说明凝集素与脂多糖相互作用后发生了变构。凝集素与脂多糖的结合能力是其抗菌活性的先决条件。因此，一些凝集素可以通过结合细胞表面聚糖在细菌细胞壁上发挥抗菌作用[45]。

一些蘑菇凝集素还具有抗真菌活性。橙黄网孢盘菌凝集素与总状毛霉菌的细胞壁结合，表现出抗真菌活性[46]。橙黄网孢盘菌凝集素通过对真菌表面L-岩藻糖（L-focuse）的特异性识别结合与总状毛霉细胞表面相互作用[46]。裂褶菌凝集素粗提物对黑曲霉具有抗真菌活性[47]。桔黄裸伞凝集素体外培养条件下对黑曲霉体有抑制作用[48]。裂褶菌凝集素的抗真菌活性可能是由于其对N-乙酰氨基葡萄糖结合的特异性，N-乙酰氨基葡萄糖是真菌细胞表面成分几丁质的重复单位。广叶绣球菌凝集素对菌丝真菌和酵母细胞具有抗真菌活性。甘露聚糖和海带素也是真菌细胞壁的主要成分，圆二色光谱显示，广叶绣球菌凝集素与这些残基的相互作用呈现出近似于螺旋状的构象变化[49]。基于蘑菇凝集素对碳水化合物的特异性，使其可能与真菌细胞壁结合并抑制真菌生长。凝集素与真菌菌丝结合后，会导致真菌营养物质吸收障碍，或破坏细胞壁的合成，从而抑制其生长。蘑菇凝集素具有抗真菌活性，同时又具有低环境毒性，是一种很有前途的微生物生防制剂。

4.6 抗氧化活性

抗氧化剂（Antioxidants）是一类能帮助捕获并中和自由基，从而祛除自由基对有机体损害的一类物质。砷的毒性主要是诱导损伤从而导致大量自由基的生成，对有机体产生损害。在蘑菇中，佛罗里达侧耳凝集素对砷引起的大鼠肾毒性表现出抗氧化活性。佛罗里达侧耳凝集素还可以阻断砷介导的超氧化物歧化酶基因mRNA 表达下调。因此，佛罗里达侧耳凝集素有可能调节砷介导的毒性恢复作用。在氧化应激情况下，蘑菇凝集素可以通过与氧化级联作用、金属离子螯合和氧猝灭以及阻碍膜脂过氧化反应等方式清除自由基，从而保持膜完整性。因此，凝集素的抗氧化活性可用于多种自由基介导疾病的治疗。

4.7 蘑菇凝集素的应用

蘑菇凝集素具有识别各种糖聚合物和介导各种细胞表面相关生物反应的能力。基于这种特性，各种蘑菇源凝集素已成为单细胞物种和微生物生物学特性研究和分类鉴定的重要工具。胚胎发育过程中，与细胞分化相伴的是细胞膜表面蛋白聚糖和脂多糖的变化，因凝集素对各种聚糖特异识别和结合的特性，使其可以作为胚胎发育过程中细胞分化研究的重要工具。同时，基于蘑菇源凝集素对聚糖的特异性，还可以用于糖尿病的检测试剂。

蘑菇凝集素可以作为癌症标志物诊断试剂已经引起了许多研究人员的广泛关注。各种新的蘑菇凝集素针对不同的癌细胞系专一性正在探索。凝集素对免疫系统的调节作用，以及抗氧化作用也是蘑菇凝集素研究的热点。

总之，蘑菇凝集素可作为开发抗癌、免疫调节、抗菌、抗病毒和抗氧化药物的重要工具。同时，各种蘑菇源凝集素还可以作为分类，发育，生理生化研究的重要工具。但是，蘑菇凝集素在实际应用开发中还存在很多困难，我们应寻找解决这些困难的途径和方法，以便最大限度地提高其利用率。