内生菌与植物耐盐研究进展

马成英，赵文娜，韩虎强，张相锋

（伊犁师范大学/伊犁师范大学微生物资源保护与开发利用重点实验室，新疆伊宁 835000）

粮食短缺是21 世纪全球关注的主要问题之一。为了满足日益增长人口对粮食的需求，必须采取有效措施提高农业的可持续性。据估计，全世界有36%的人口依靠农业获得食物和经济收入。目前，农业生产受到气候变化的影响较大，容易使粮食安全受到威胁[1]。气候变化对农业影响取决于许多因素，如温度、天气、降水、大气中的二氧化碳等，这些因素要么导致低产量，要么导致植物的损伤。另据报道，全球大约有6%土地受到盐渍化的严重影响，其中有20%世界灌溉地和2%旱地受到盐渍化的影响[2-4]。

土壤盐渍化会对植物造成渗透和离子胁迫，从而抑制植物的生长。渗透胁迫是由于细胞外的高渗环境而暴露在盐度下立即产生的，而离子胁迫则是由于细胞内Na+和Cl-离子在一定时期积累后产生的。渗透胁迫影响细胞内的水分平衡，降低细胞膨压、抑制细胞伸长和细胞分裂。Munns 报道，离子胁迫改变了细胞内离子稳态，导致激素状态、蒸腾、光合作用、营养物质转运等新陈代谢过程的改变[5]。目前，对植物耐盐性的研究集中在维持盐平衡和离子稳态上，传统耐盐品种育种方法由于周期长、产出率低，大多数科学家已不再采用；在植物耐盐性维持研究方面，基因工程技术可能是有效的，但成本较高。在开发盐碱地过程中，通过土壤中有益微生物增加植物耐盐性是一种有效的替代方法[6]，植物根际的微生物对植物的生长和耐盐性有显著的促进作用，这些微生物增强了土壤-水分-植物之间的关系，控制了植物激素信号，并触发了其他一些机制，最终以综合的方式增强植物的耐盐性和抗旱性[7-8]。植物益生菌主要包括促进植物生长的细菌（PGPB）、丛枝菌根真菌（AMF）和其他内生菌。然而，对微生物介导的植物促生机制方面需要进一步深入的研究。

目前越来越多研究表明，植物对胁迫的耐受能力与其相伴的微生物有密切关系[9-11]。然而，在干旱、盐碱、重金属和极端条件下，大多数微生物对植物生长并无益处，它们也无法在极端条件下生存，这给研究人员开发适用于这种极端条件的生物菌剂带来了挑战[8,12]。本研究特别关注了内生细菌在植物耐盐胁迫中的作用，并简要介绍了土壤盐碱化及微生物在植物盐胁迫中的耐盐机制，以及全面综述了利用植物内生菌对抗盐胁迫的研究和在盐胁迫条件下如何开发植物内生菌促生潜力。这些信息将有助于提高人们对内生菌的认识，以便开展收集植物益生内生菌增强植物抵抗盐胁迫研究的数据，进而指导和促进盐碱环境下的农业生产和实践。

1 土壤盐碱化的原因

土壤盐碱化是限制作物产量的主要因素，也是造成作物损失的最大因素。不同植物耐盐度阈值是不同的。土壤盐碱化是由自然和人为活动引起的，自然过程是造成盐度升高的主要原因，次生盐渍化是由于人类不科学农业活动所导致，如不规范低质量水灌溉、土地清理、排水不畅和其他不良农业措施。与旱地相比，灌溉地更容易发生盐碱化，灌溉导致盐碱化是一个严重问题，因为灌溉土地为世界提供了大量的粮食。盐分积累使土壤物理条件恶化，碱度增加，在高盐度下，土壤中Ca2+和Mg2+等阳离子被Na+离子所取代，从而增加了土壤颗粒的分散性。此外，盐分还通过降低共生细菌的固氮酶活性对结瘤过程产生负面影响，从而导致植物含氮量降低[13]。因此，盐分不仅影响作物生产力，而且对土壤微生物也会产生负面影响。

2 植物耐盐机理

植物天生具有应对不同胁迫条件的能力。根据抗盐胁迫能力，植物可分为两类：非盐生植物和盐生植物。非盐生植物是盐敏感植物，对盐胁迫耐受能力很低，而盐生植物能耐受高浓度盐分。大多数作物对盐敏感，属于非盐生植物。植物抗性水平取决于其遗传特性和相关的生物因子。植物有自己的免疫系统，其中不同的生理机制在一个信号级联中起作用，并诱导对胁迫的耐受。此外，植物相关微生物在逆境条件下对植物的生存也起着关键作用[9]。

2.1 植物自身系统耐盐性

植物通过质膜受体感知胁迫信号，进而启动不同信号转导途径，涉及胁迫从根到芽的远距离信号传递。在盐胁迫下，植物根系首先感受到盐的渗透胁迫和离子胁迫，并迅速对变化的信号产生反应。植物对盐分的反应是改变其生理、生化和分子机制。渗透胁迫过程中，植物通过降低细胞伸长和细胞分裂，抑制幼叶生长、枝条和侧根形成，关闭气孔等表型变化来维持水分含量。此外，植物在盐胁迫下保持茎根比得以生存，因为较重根会积累更多的盐，并且不允许转移到植物上部[14]。其次，植物的这些表型变化受生长素、赤霉素、细胞分裂素、脱落酸和乙烯等不同的激素控制[15]。植物激素的产生是相互依赖的，并在综合信号通路中发挥作用。

在细胞水平上，盐离子被隔离在液泡中，扰乱了细胞的渗透平衡。结果水从细胞质渗出到细胞外空间，导致细胞脱水。为了保持这种渗透压，植物在细胞质中积累低分子量的有机化合物，这些化合物与代谢活性相容，称为相容性溶质。渗透胁迫过程中积累主要溶质是脯氨酸、甘氨酸甜菜碱、海藻糖、甘露醇和蔗糖[16]。相容溶质也起着生物膜、蛋白质和酶的渗透保护剂作用，它们有助于在脱水条件下稳定亚细胞结构，清除自由基，保护植物免受氧化损伤。

随着渗透胁迫出现，植物光合速率下降，气孔进一步关闭，叶面积减少，以防止水分流失。植物细胞有一种机制来降低活性氧浓度，增加所产生的毒性，细胞产生抗氧化物质能清除活性氧，并将其转化为非活性形式。在胁迫条件下，抗氧化酶活性的增强被认为是植物的一种耐受机制[17]。抗坏血酸和谷胱甘肽含量也被报道在盐胁迫下增加[17-18]。此外，植物次生代谢产物，如生育酚、类胡萝卜素、类黄酮、多胺和酚类化合物，对氧化应激具有保护作用[19]。在长时间盐胁迫下，植物会受到离子胁迫的影响，Na+大量积累会导致细胞毒性。为了避免Na+毒性，植物采取了2 种不同的机制：一是增加细胞内的隔室或空泡隔离，二是增加Na+的浓度[20]，这些机制的效率决定了植物耐盐性。糖原植物通过排除根中的盐来维持Na+活性，而盐生菌通过使用液泡膜的Na+/H+泵来改善离子区隔[21]。此外，植物激活高亲和力的K+转运蛋白（HKT），抑制根系对Na+的吸收[22]。HKT 使K+离子高于Na+离子，从而提高植物的耐盐性。

2.2 生境增强植物耐盐性

植物在逆境条件下通过与微生物共生而改善营养，这种现象被称为生境适应共生[23]。共生组合是由存在于土壤中大量微生物组成的，如细菌、古细菌和真菌等。这些微生物有潜力适应胁迫环境，当它们与寄主植物联系在一起时，有助于促进植物生长。微生物促进植物生长的机制有直接和间接2 种，在直接作用机制中，微生物通过营养物质的增溶、固氮和铁载体的产生以及植物组织内激素水平的调节，来提高植物对养分的吸收效率；在间接作用机制上，微生物降低了病原菌侵染对植物的破坏作用。有报道，PGPB 介导挥发性有机化合物可以提高植物在胁迫条件下的耐性和促进生长[24]。

在植物抗逆促生作用中，内生微生物比根际微生物更有效，因为这些微生物驻留在植物组织内，并与植物细胞接触，发挥直接的有益作用[25-26]。有研究表明，在高盐条件下生长的盐角草属植物相关微生物群能够抵抗不同的非生物胁迫，并能促进盐和干旱条件下植物生长[27]。耐盐植物内生菌是PGPB 的良好来源，应大力开发其在农业系统中的应用，促进作物耐盐性[28-29]。在这方面，Sorty 等[29]报告了与盐生植物补骨脂相关的内生细菌肠杆菌菌株，有提高盐胁迫下小麦种子活力指数的潜力。此外，内生细菌群落能够保护植物免受植物病原菌的侵扰，它们通过产生多种化合物，如抗生素和水解酶，抑制病原菌的生长并诱导植物产生抗性[31]。

3 内生细菌及其多样性

植物根际微环境是各种潜在细菌的贮存库，内生细菌构成植物根际细菌群落的一部分。Galippe 首先提出根际存在的细菌有可能进入植物细胞和组织[32]。后来，一些研究证实植物内部通常有一系列内生细菌定殖[33-36]。这些研究表明，内生菌不仅在根际有定殖作用，而且在根、茎、叶、花、果和籽等不同的植物组织中也有定殖作用。一般来说，最丰富的内生细菌群落是变形杆菌（～50%），其次是厚壁菌（～10%）、放线菌（～0%）和细菌（～10%）。最常见的内生菌属有芽孢杆菌属、伯克霍尔德菌属、假单胞菌属、寡养单胞菌、微球菌属、泛菌属和微杆菌属[37-40]。

内生细菌群落进入植物组织的主要切入点是通过初生根和相关的侧根，从而进入组织伤口。因此，内生细菌的种群密度因组织而异。另一项研究报告称，植物与内生细菌群落之间的联系是通过各种化合物的作用介导的，这些化合物通常由微生物和宿主细胞产生[41]。内生菌定殖方式也可分为专性定殖、兼性定殖和被动定殖。专性细菌只存在于种子中，能定植整个植物；兼性细菌是从土壤中产生的，当找到合适的条件时，它们会在植物上定殖；一些细菌通过伤口和裂缝进入植物，被称为被动定植模式。此外，根瘤菌也是内生菌，在植物内部组织定植并形成根瘤，进行固氮过程。Companyt 等[35]证明一种内生细菌伯克霍尔德菌（Burkholderia phytocfirmans）产生了内切葡聚糖酶和内聚半乳糖醛酸酶化合物，它们与局部细胞壁降解有关，并有助于细菌通过裂缝进入和细菌细胞穿过内胚层进入木质部，随后在根内部定殖。近年来，有研究者研究发现一些内生细菌与植物内生真菌共生现象。Desirò等[42]证明与柔膜细菌相关的内生细菌直接嵌入到内生毛霉真菌中，这是一种新的植物共生体。

内生菌的多样性是通过培养依赖和培养独立的亚基因组方法来实现的。直接从植物组织中扩增微生物DNA 和现代生物信息学工具的应用为细菌内生菌的分析提供了更好的方法。此外，不依赖培养的技术提供了对微生物群落更深入的分析，有助于提高我们对特定植物中微生物群落多样性的理解。最近，许多研究通过宏基因组方法，广泛收集了一些有关内生细菌群落多样性的信息[43-46]。此外，基因富集策略和16S rRNA 基因文库技术也为研究不同农业植物的微生物群提供了有效手段[47-49]。

内生菌的多样性易受农事活动等生物和非生物因素的直接或间接影响。耕作和灌溉等农业农事活动改变了土壤特性，如破坏、压实、孔隙大小等，从而破坏了土壤微生物多样性。农药和化肥的过量使用直接抑制了土壤微生物的生长，导致土壤微生物总体数量的下降。此外，内生群落还受到微生物-微生物及植物-微生物互作的影响。植物生理状态差异和植物根系分泌物成分的变化，也可能会影响内生细菌的生长。

总而言之，上述研究表明细菌能够在整个植物的内部定殖。但根与土壤的关系最为密切，是内生细菌侵染的主要场所。此外，植物根系作为一个“门通道”来对大量多样微生物进行筛选，并使植物组织只招募有益的微生物。因此，与植物内生微生物群落相比，根际微生物群落更为复杂。

4 内生细菌在作物盐胁迫适应中的作用

内生细菌已被成功地用于克服盐胁迫的负面影响，促进植物在逆境条件下生长。植物内生菌主要是通过渗透调节、解毒、激素调节和养分获取等生理活动，减轻盐胁迫的危害。

4.1 渗透调节剂和抗氧化物的积累

植物内生菌通过渗透剂和抗氧化剂的积累，稳定细胞成分和清除自由基来减少盐胁迫对植物的影响。据报道，有节杆菌属和芽孢杆菌属2 种内生菌株，在渗透胁迫下刺激辣椒植株脯氨酸含量的积累，还可以调节辣椒植株中的胁迫诱导基因，缓解了渗透胁迫条件[50]。近期，Abd Allah 等[51]研究了盐渍条件下内生细菌枯草芽孢杆菌BERA 71 对鹰嘴豆植株的影响，与未接种细菌的植物相比，接种植物表现出更高的抗氧化酶、SOD、POD、CAT 和GR 活性、非酶抗氧化剂、抗坏血酸和谷胱甘肽以及总酚含量。

4.2 脱氨酶活性

乙烯在植物胁迫响应信号中起着中介作用。低含量乙烯对植物生长发育很重要，而胁迫诱导条件下乙烯的积累通常会抑制植物生长[52]。ACC 是乙烯生产的前体，在ACC 氧化酶的催化下转化为乙烯[53]。内生细菌通过ACC 脱氨酶活性调节植物体内乙烯的产生。在这一机制中，细菌作为ACC 储存库，降低植物体内ACC 的水平，并在胁迫条件下防止乙烯抑制植物生长。据报道，大多数ACC 脱氨酶产生菌来自根际，它们能够有效保护植物免受生物和非生物胁迫的危害[54-56]。然而，含有ACC 脱氨酶活性的内生细菌在胁迫条件下可能是一种很好的植物生长促进剂，因为它们在每个特定位置阻止乙烯的产生[57]。有研究表明，从盐生植物补血草分离到的ACC 脱氨酶内生细菌种类很多，主要有孢杆菌、假单胞菌、克雷伯菌、沙雷氏菌、节杆菌、链霉菌、白蚁菌和微杆菌等，这些细菌能够显示出与高盐浓度相关的ACC 脱氨酶特性，ACC 脱氨酶活性降低了盐胁迫对寄主植物的氧化和渗透损伤[58]。Lowman等[59]在不同区域的实地研究中评估了柳枝稷草中的内生植物伯克霍尔德菌PsJN 的产生ACC 脱氨酶能力。

除了应激反应外，乙烯还调节植物组织内生定殖，较高的乙烯含量会降低细菌与其寄主植物的定殖效率[60]。Iniguez 等[61]2005 年进行了一项实验，通过建立肺炎克雷伯菌342 株与截形苜蓿的内生关系，发现细菌与植物的定殖受乙烯的控制。因此，ACC 脱氨酶活性可能有助于降低植物体内乙烯水平，从而提高PGPB 内生菌的定殖效率。总的来说，内生细菌产生的ACC 脱氨酶降低了植物体内乙烯水平，减轻了在该激素胁迫条件下的破坏作用。

4.3 植物激素调节

植物内生细菌还可以调节植物体内必需的植物激素水平，为植物提供增益作用，并在胁迫条件下促进生长。最近一项研究表明，细菌内生菌溶淀粉芽孢杆菌RWL-1 产生ABA，有可能提高水稻植株的耐盐性[62]。接种RWL-1 显著提高了水稻植株必需氨基酸的含量，诱导植株内源水杨酸的产生，有助于水稻在盐胁迫下的存活。赤霉素作为促生长激素在促进芽的生长中发挥作用。鞘氨醇单胞菌（Sphingomonas sp.LK11）是从豆科植物载碱毛豆中分离得到一种内生细菌，具有产生赤霉素的能力。该菌株的杀菌作用可以促进番茄植株生长和叶绿素含量增加[63]。Vendan 等[64]从人参茎中分离出了51 种显示IAA 产生活性的内生细菌。这些内生菌主要是厚壁菌、放线菌、α-蛋白细菌和γ-蛋白细菌。Bhore 等[65]从忧遁草中分离了产生细胞分裂素的内生菌，即树脂假单胞菌和多粘菌。将这些细菌培养物的提取物接种到黄瓜子叶中进行离体培养，并显示出促进植物生长的作用。总体来讲，植物内生菌通过调节其寄主植物的激素信号，促进植物生长和提高胁迫条件下的耐受性。

4.4 提高养分吸收效率

化肥使用的不平衡造成了许多严重环境问题，对于农业可持续发展来讲，微生物基肥料是替代纯化学肥料的良好资源。内生菌能够溶解一些矿物质并将大气中的氮固定到植物体内。本研究主要讨论植物主要的营养成分和内生菌对它们的吸收促进。

4.4.1 氮。氮是核酸和蛋白质合成的重要组成部分，对生物体生长和健康起着至关重要的作用。在农田中，氮肥占作物总肥料的30%。此外，30%～50%的氮源于土壤微生物对大气中氮的生物固氮作用。内生细菌比根际细菌有更高的固氮效率，因为植物内部为其提供了一个低氧环境，这是固氮的必要条件。然而，它们对植物氮库的贡献有多大还需要进一步研究。在豆科植物中，在根瘤形成过程中，固氮酶将大气中的氮还原为氨。根瘤中的微生物被称为根瘤菌，属于不同的属，如根瘤菌、中华根瘤菌、缓生根瘤菌、中根瘤菌、偶氮根瘤菌等。Sessitsch 等[48]在水稻内生菌宏基因组研究中发现，根内菌群具有固氮相关基因，提示这些内生菌可能参与了氮循环过程。Puri 等[66]分离鉴定出多粘类芽孢杆菌（Paenibacillus polymyxa）P2b-2R，它能够定殖玉米植株的根际和内部并促进其生长。

4.4.2 磷。磷是限制植物生长的主要营养元素之一，它在植物生物量积累中有着重要的作用。大多数磷以固定化形式存在，不能直接被植物利用。许多具有溶磷活性的微生物已经被分离出来，它们可以帮助植物更有效地利用磷肥，这些微生物可以在植物根表面和组织内部定殖。Dias 等[67]从草莓中分离出2 种能够溶解磷酸盐和促进植物生长的细菌内生菌，即枯草芽孢杆菌和巨大芽孢杆菌。

4.4.3 铁。铁是植物必需微量元素，参与许多酶促反应。它以高度不溶性氢氧化物形式存在于土壤中，不能直接被植物利用。Choudhary 等[1]研究表明，土壤微生物有能够螯合铁，并通过铁载体将其转化为可溶性复合物，使其可被植物利用[1]。这些微生物有助于植物在低铁土壤中生存。Sessitsch 等[48]在一项研究中证实，水稻根微生物的基因组中含有丰富的铁载体合成、接收和铁储存相关蛋白质的基因，内生菌通过这些基因的表达帮助植物吸收铁。

5 展望

微生物介导的植物抗逆性是一种生态友好的方法，可以更好地促进植物生长和提高产量。益生菌是农用化肥和农药的最好替代品。目前研究植物益生菌大多是自然界中的根际微生物，其中小部分是内生菌。Companyt 等[68]指出根际微生物受到环境因素的影响较大，在胁迫条件下会失去促进植物生长的能力，而内生菌由于免受外部环境中的生物和非生物因素影响，比根际微生物更具优势。因此，内生菌已成为逆境条件下促进植物生长和提高产量的潜在工具，有必要将研究重点放在探索植物在不同生长阶段内生菌种群的多样性及其在植物生长促进和胁迫耐受中的作用上，并需要对其与植物相互作用机理进行详细的研究。另外，还需要发现更多能够赋予植物对抗各种胁迫耐受能力的其他潜在微生物，而且不同植物在不同环境中是否具有相同的表现仍有待进一步研究。深入分析植物和细菌在定殖过程中表达与定殖作用相关的基因，将有助于提高我们对植物内生定殖机制的认识。微生物介导的植物生长促进作用不是由单一因素决定的，而且存在多种信号间串扰的可能性，找出其关键决定因素并非易事，需要更多学者加大这方面的研究力度。

近些年，科研人员一直关注一些尖端技术，特别是“组学技术”，如宏基因组学、蛋白质组学和代谢组学、高通量DNA 测序和其他不依赖于培养的技术，有助于揭示更多有关不可培养的内生微生物信息。同样，蛋白质组学和代谢组学以及先进计算数据挖掘方法相联合，可能有助于理解内生菌及其与宿主植物的相互作用。通过基因工程技术可以改善内生菌的性状来开发新的内生菌株。利用高通量技术可以开发内生菌在低投入、可持续和生态友好方面的作用，更好地帮助植物适应逆境。

植物内生菌作为胁迫条件下植物促生长的重要因素，在农业可持续发展中有着广阔应用前景，但要想使其得到广泛推广应用，还有许多有待解决的科学问题。随着相关研究持续开展，人们发现植物促生内生菌的种类也越来越多，对这些数量庞大微生物群体的培养、保存和管理，存在许多需要解决的问题；对于植物体内微生物群体之间相互作用机制的认知，还有大量工作要做。我们还面临着另一个非常重要的问题，那就是目前的研究成果大多是建立在实验室条件下，需要加强由实验室到田间的试验力度，获取更充分的内生菌促生作用的田间试验数据，使农民能够充分认识到促生内生菌对植物生长和土壤健康的积极作用，为促进促生内生菌在农业生产中有效利用打好基础。另外，还需要对与植物产生协同效应的“植物-真菌-细菌”三者共生体进行进一步的研究。综合目前研究成果，可以发现促生内生菌在盐碱地改良和农业可持续发展中有广阔的应用前景，但是这些都是建立在我们对植物内生共生体在提高植物整体抗逆性机制的充分了解之上。