富于淋巴细胞型乳腺癌中PD-L1和CD8+TILs的表达及临床意义

杨月 张会芳 陈妙玲 韩玉贞

滨州医学院附属医院病理科 256600

乳腺癌是全球女性最常见的恶性肿瘤，且近年来其发病率和病死率仍在不断增加［1］。免疫治疗是继手术、放化疗等治疗之外新兴的治疗手段，程序性死亡配体-1（programmed death ligand-1，PD-L1）是免疫治疗的重要靶点，PD-L1通过与淋巴细胞，主要为CD8+肿瘤浸润淋巴细胞（tumor-infiltrating lymphocytes，TILs）表面程序性死亡受体-1（programmed death-1，PD-1）结合发挥其免疫抑制作用。近年来有关PD-L1和CD8+TILs在乳腺癌中的研究较多，但结果很不一致［2-6］。由于大多数乳腺癌TILs较少，而PD-L1的免疫抑制作用是以肿瘤淋巴细胞浸润为前提［7］，这可能是研究结果不一致的原因之一。富于淋巴细胞型乳腺癌（lymphocyte-predominant breast cancer，LPBC）是一类富含淋巴细胞的乳腺癌，且瘤内和间质含有丰富的CD8+TILs，以LPBC为研究对象能更好地探讨PD-L1和CD8+TILs表达之间的关系。为此，本研究探讨LPBC中PD-L1和CD8+TILs的表达与临床病理特征及预后的关系。

资料与方法

1、资料

选取滨州医学院附属医院病理科2011年1月至2018年12月有完整临床病理资料的LPBC 60例，包括年龄、肿块大小、淋巴结状态、组织学分级和Ki-67增殖指数。由2名病理医师参照国际TILs工作组2014年提出的评估标准［8］对TILs进行评估，LPBC定义为乳腺癌间质TILs≥50%（图1A）。纳入对象均为女性，在术前均未接受过治疗。通过电话或查询病历对LPBC患者进行术后随访，时间截止至2021年12月或患者死亡，中位随访时间78个月（22～127个月）。

2、纳入和排除标准

纳入标准：⑴入组患者均诊断为浸润性导管癌，并由2名病理医师参照相关标准评估为LPBC；⑵入组患者均具有完整的临床病理资料，包括年龄、肿块大小、淋巴结状态、组织学分级和Ki-67增殖指数；⑶LPBC试验标本均为手术切除大标本；⑷入组患者术前均未进行任何治疗，包括新辅助放、化疗，靶向治疗，内分泌治疗。排除标准：⑴病理及临床资料不完整的患者；⑵乳腺穿刺标本；⑶其他部位的恶性肿瘤转移到乳腺的患者；⑷术前进行过治疗，包括新辅助放、化疗，靶向治疗，内分泌治疗。

3、方法与试剂

应用免疫组化EnVision法染色。用10%中性福尔马林溶液对标本进行固定，石蜡包埋，4 µm厚连续切片，常规烤片、脱蜡、水化处理后，采用EDTA抗原修复液修复，3% H2O2阻断内源性过氧化物酶活性，滴加PD-L1（SP142，1∶50）、CD8一抗37℃放置2 h后弃去，滴加酶标山羊抗小鼠/兔免疫球蛋白（Ig）G聚合物二抗，37℃孵育30 min，DAB显色，苏木精复染，盐酸乙醇分化，脱水透明，中性树脂封片。用扁桃体组织作为阳性对照，用PBS代替一抗作为阴性对照。一抗PD-L1购自美国Abcam公司，CD8、二抗均购自北京中杉金桥生物技术有限公司。LEICA EG1160包埋机、LEICA RM2245切片机均购自德国LEICA公司，漂片烘片仪购自杭州中威电子制造，37℃恒温箱购自湖南湘仪实验室仪器开发有限公司。

4、结果判读

⑴PD-L1阳性判读标准：PD-L1阳性定位于细胞膜或细胞质（图1B、C），任何强度PD-L1染色的肿瘤细胞（tumor cell，TC）或免疫细胞（immune cell，IC）为阳性细胞，分别记录阳性TC和IC在肿瘤细胞巢和肿瘤周围间质中所占的百分比，≥1%定义为阳性，＜1%为阴性［9］。⑵CD8判读标准：CD8阳性着色定位于为细胞膜或细胞质（图1D），接触或位于肿瘤细胞巢内的淋巴细胞定义为iTILs，而间质区域内的淋巴细胞被定义为sTILs，不包括导管原位癌和正常乳腺组织周围间质TILs。⑶CD8+iTILs和CD8+sTILs的判读标准：低倍镜下观察全片，排除热点区域，选取5个高倍视野（400×）并用CellSens Entry软件进行阅片，用多边形工具分别勾勒出肿瘤细胞巢和间质区域的面积，分别计数肿瘤细胞巢和间质区域中CD8+细胞数，CD8+TILs的密度以阳性细胞数/mm2表示。

图1 A：富于淋巴细胞型乳腺癌，sTILs≥50%（HE染色200×）；B：PD-L1在 肿 瘤 细 胞 中 呈 阳 性（EnVision法200×）；C：PD-L1在免疫细胞中呈阳性（EnVision法200×）；D：CD8在间质和瘤内Tils中的表达（EnVision法100×）

5、统计学分析

采用SPSS 25.0统计软件对数据进行分析。采用卡方检验或Fisher精确检验分析LPBC中PD-L1和CD8+TILs表达与临床病理特征之间的关系，采用Spearman秩相关检验分析PD-L1和CD8+TILs表达的相关性，采用Kaplan-Meier法进行生存分析并行Log-Rank检验。P<0.05表示差异有统计学意义。

结 果

1、LPBC患者的临床病理特征

本文共筛选出LPBC 60例，患者均为女性，中位年龄51岁（29～71岁），肿块中位直径为2.5 cm（1.5～6.5 cm），淋巴结转移率40.0%（24/60）。组织学类型均为浸润性导管癌，其中组织学分级Ⅰ级0例，组织学分级Ⅱ级42例，组织学分级Ⅲ级18例。60例LPBC患者中位随访时间为78个月（22～127个月），在随访期间有4例患者复发（6.7%）、3例患者死亡（5.0%）。

2、TC和IC中PD-L1的表达与LPBC临床病理特征的关系

PD-L1在肿瘤细胞中的阳性表达率为26.7%（16/60），PD-L1在免疫细胞中的阳性表达率为73.3%（44/60），总PD-L1阳性表达率为81.7%（49/60）。PD-L1在肿瘤细胞中的表达与组织学分级有关（P=0.041），与年龄、肿块大小、有无淋巴结转移、Ki-67均无关（均P>0.05）。PD-L1在免疫细胞中的表达与肿块大小（P=0.004）、Ki-67有关（P=0.001），与年龄、组织学分级、有无淋巴结转移均无关（均P>0.05）。见表1。

表1 PD-L1与60例LPBC患者临床病理特征的关系

3、不同部位CD8+TILs与LPBC患者临床病理特征的关系

本研究CD8+TILs检测数值：CD8+sTILs中位数为807（295～2 454），CD8+iTILs中位数为108（0～634）；以中位数为临界值分为低密度组和高密度组。CD8+sTILs和CD8+iTILs的表达与年龄、肿块大小、有无淋巴结转移、组织学分级、Ki-67差异均无统计学意义（均P>0.05）。见表2。

表2 不同部位CD8+TILs与60例LPBC患者临床病理特征的关系

4、LPBC中PD-L1和CD8+TILs的相关性分析

肿瘤细胞中PD-L1的表达与CD8+iTILs的表达呈正相关（rs=0.301，P=0.019），免 疫 细 胞 中PD-L1的 表 达 与CD8+sTILs的表 达 无明 显 相关 性（rs=-0.155，P=0.239），见图2。

图2 60例LPBC中PD-L1和CD8+TILs的相关性分析。A：肿瘤细胞中PD-L1和CD8+iTILs表达的相关性；B：免疫细胞中PD-L1和CD8+sTILs表达的相关性

5、PD-L1和CD8+TILs的表达对预后的影响

肿瘤和间质PD-L1表达与患者的无瘤生存期（disease free survival，DFS）和总生存期（overall survival，OS）均无显著相关性（均P>0.05）。CD8+sTILs高密度组与较长的DFS相关（P=0.037，图3A），CD8+sTILs的表达与OS无显著相关性（P=0.084，图3B）；CD8+iTILs高密度组与较短的DFS相关（P=0.042，图3C），CD8+iTILs的表达与OS无显著相关性（P=0.076，图3D）。

图3 60例LPBC患者的Kaplan-Meier生存曲线。A：不同密度CD8+sTILs与无瘤生存期的关系；B：不同密度CD8+sTILs与总生存期的关系；C：不同密度CD8+iTILs与无瘤生存期的关系；D：不同密度CD8+iTILs与总生存期的关系

讨 论

肿瘤微环境包括免疫细胞、肿瘤相关成纤维细胞、细胞外基质等间质成分，乳腺癌细胞和间质细胞之间复杂的相互作用，在乳腺癌的发生发展中发挥着重要作用，并因其具有潜在的治疗靶点而倍受关注［2］。许多研究表明，sTILs密度高的患者预后较好，TILs可作为判断乳腺癌预后的指标，其中CD8+TILs在杀灭癌细胞方面发挥着重要作用［10］。肿瘤浸润淋巴细胞按照所处的部位不同分为间质浸润淋巴细胞和瘤内浸润淋巴细胞。Catacchio等［11］研究发现，总CD8+T细胞与DFS无显著相关性，而CD8+iTILs高表达的患者显示出更差的5年DFS，CD8+sTILs高表达的患者显示出更好的5年DFS。Chen等［12］研 究 显 示，淋 巴 结 阴 性 乳 腺 癌 中CD8+iTILs高表达与DFS和OS的改善有关。Liu等［13］对3 403例浸润性乳腺癌的研究发现，32.4%的患者每0.6 mm直径的组织芯片至少有1个CD8+iTIL，60.6%的患者至少有1个CD8+sTIL；由此看出，非LPBC患者CD8+TILs数量较少，尤其是CD8+iTILs数量更少，经常被研究者们忽略。iTILs与肿瘤细胞直接接触，可以更好地发挥肿瘤免疫作用。本文选取的是富于TILs的一类乳腺癌，能够更好地反映瘤内和间质CD8+TILs与预后的关系。本研究显示CD8+sTILs高表达患者具有更好的DFS，而CD8+iTILs高表达组显示更差的DFS，提示不同部位CD8+TILs对乳腺癌有不同的预测预后作用。本研究还发现肿瘤细胞PD-L1表达与CD8+iTILs表达呈正相关，肿瘤细胞PD-L1抑制了CD8+iTILs的肿瘤免疫作用，这可能是CD8+iTILs高表达患者预后差的原因。

PD-1/PD-L1免疫检查点通路是诱导乳腺癌免疫逃逸的重要机制之一，PD-L1与PD-1结合可抑制T淋巴细胞的激活、增殖和细胞毒性细胞因子的分泌［14］。近期美国食品药品监督管理局（FDA）批准阿替利珠单抗（atezolizumab）联合化疗（abraxane，紫杉醇）用于治疗PD-L1阳性的局部晚期或转移的三阴性乳腺癌（TNBC）患者［15］。一项基于2 500例乳腺癌的meta分析显示PD-L1阳性率在21%～56%范围内［16］。本研究显示PD-L1在免疫细胞中的表达显著高于肿瘤细胞中的表达，这与大多数研究结果一致［6，17］，然而PD-L1在LPBC中的总阳性表达率高达81.7%。PD-L1在LPBC中高表达可能与高浸润性TILs介导的适应性免疫反应有关，诱导肿瘤细胞表达PD-L1发挥免疫抑制作用。有研究表明，在所有类型的乳腺癌中，较短的OS和PD-L1表达之间存在关联［18］；但也有研究显示，在TNBC中，PD-L1阳性患者预后更好［19］。Huang等［20］研究发现TC中PD-L1的表达与大直径肿块、高组织学分级、高Ki-67、ER和PR阴性相关。Calik等［21］研究发现，在结直肠癌患者中肿瘤细胞PD-L1高表达与预后不良相关，而免疫细胞中PD-L1的高表达与预后良好相关。本研究表明，PD-L1在肿瘤细胞中的表达与组织学分级有关，PD-L1在免疫细胞中的表达与肿块大小和Ki-67有关；PD-L1无论在肿瘤细胞还是免疫细胞中的表达都与DFS和OS无相关性。由于该类乳腺癌预后好，病死率低，本研究的病例相对较少，可能没能更好地反映PD-L1与预后的关系；但从与一些预后相关的临床病理参数分析来看，PD-L1阳性表达与一些不良的临床病理参数相关。

免疫治疗开始时，治疗效果在很大程度上是由肿瘤内已经存在的TILs介导的，主要是CD8+TILs，具有丰富CD8+TILs的乳腺癌可能对PD-L1免疫抑制剂有更好的疗效。有关PD-L1和CD8+TILs的相关性研究多集中于乳腺癌间质，而有关肿瘤细胞内两者相关性的研究少报道。在一项对早期乳腺癌的研究中发现，CD8+TILs的表达与PD-L1表达呈负相关［22］。一项对180例乳腺癌患者组织微阵列的研究中发现，CD8+iTILs表达与免疫细胞PD-L1表达具有相关性，而CD8+iTILs表达与肿瘤细胞PD-L1表达无相关性［21］。本研究显示，CD8+iTILs表达与TC中PD-L1表达呈正相关（rs=0.301，P=0.019）。浸润的CD8+细胞毒性T细胞分泌的干扰素（IFN）-γ是诱导PD-L1表达所必需的［21］，肿瘤细胞PD-L1的表达可能是适应性机制的结果［19］。因此，针对PD-L1的免疫治疗，CD8+iTILs高表达患者可能具有较好的疗效。然而抗PD-L1单药治疗的有效率只有5%～20%［18］，既然免疫检查点抑制剂的应用是以肿瘤淋巴细胞浸润为前提，在非LPBC中TILs数量较少，这可能是抗PD-L1治疗有效率低的原因之一。我们在对LPBC的研究中发现，间质PD-L1和CD8+TILs的表达无相关性，这可能会降低该类患者PD-L1免疫治疗的疗效；随着对LPBC中肿瘤和间质PD-L1和CD8+TILs的表达进行更深入的研究，可能有助于提高免疫治疗的有效率。

综上所述，间质和瘤内CD8+TILs对LPBC显示不同的预后预测作用，CD8+iTILs表达与TC中PD-L1表达呈正相关，这可能是CD8+iTILs高表达患者预后差的原因之一，CD8+iTILs高表达的患者可能对PD-L1免疫抑制剂显示更好的疗效。PD-L1与一些与预后相关的临床病理参数相关，但与DFS和OS无显著相关性。LPBC患者PD-L1阳性率较高，且预后较好；随着对LPBC中PD-L1和CD8+TILs表达研究的深入，必将为乳腺癌的免疫治疗提供重要的理论基础。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突