绒毛染色体高通量分析在自然流产染色体核型分析中的应用价值

王丽 谭卫荷 纪玲华

作者单位：广州医科大学附属第六医院/清远市人民医院产前诊断中心，广东 清远 511500

自然流产是指妊娠时间在28 周以内、胎儿体重低于1 000 g，产妇自行终止妊娠。目前自然流产的发生率较高，导致自然流产的原因较多，胚胎染色体异常因素导致的自然流产占据了自然流产的一半[1]。因此，对自然流产患者流产胚胎进行绒毛染色体检测有助于明确流产的原因。以往临床多采取流产绒毛染色体进行核型分析，但绒毛细胞的采集和培养要求均较高，导致培养成功率和分辨率均较低，无法达到理想的检测效果[2]。绒毛染色体高通量分析检测避免了传统测序技术的不足，可提高检测敏感性和准确性，且成本较低，检测周期较短，能够检测出染色体的非整倍体[3]。鉴于此，本研究旨在利用高通量测序技术检测自然流产组织绒毛染色体，旨在为下次妊娠提供指导依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料

回顾性分析2019 年1 月—2020 年12 月广州医科大学附属第六医院/清远市人民医院收治的812 例自然流产患者进行研究，年龄24 ～33 岁，平均（28.65±5.27）岁；流产孕周6 ～12 周，平均（9.51±1.03）周；首次流产286 例，复发性流产526 例。

纳入标准：（1）超声确认为宫内妊娠者。（2）患者知情同意。（3）无有害物质接触史者。排除标准：（1）存在感染史者。（2）既往存在有害物质接触史者。（3）不同意参与本研究者。

1.2 方法

1.2.1 标本准备 获取自然流产胎盘绒毛组织10 mg，生理盐水冲洗，待冲洗干净后采集流产胚胎的绒毛标本。采用德国Qiagen GmbH 公司的Qiagen Blood ＆ Tissue 试剂盒提取胚胎绒毛组织的DNA。利用紫外可见分光光度计（生产厂家：上海精科上分仪电；型号：721G 722N）测定，采用10 mg/L 的琼脂凝胶电泳（生产厂家：北京佳航博创科技有限公司；型号：HT-SUB02）对DNA 片段的完整性进行判断。

1.2.2 高通量分析测序 采用基因测序仪（生产厂家：广州万德基因医学科技有限公司；型号：NextSeq CN 500），贝瑞和康基因诊断技术，对样本染色体拷贝数进行检测。打断基因组DNA 为小片段核酸，并修复末端，加“A”和接头，再加入引物进行聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR），构建文库。通过Q-PCR 仪（美国安捷伦2100）进行文库质控，质控合格后，在NextSeq 550AR 平台，按50SE 单末端10 M 数据量测序。将测序结果利用比对软件，将每个测序标签分别匹配至对应染色体上，以对染色体拷贝数异常进行判定。

1.3 观察指标

1.3.1 观察指标 比较高通量测序染色体核型分析结果。

1.3.2 评价标准 高通量分析测序结果的判定[4]：染色体非整倍体异常及结构异常为阳性。若为致病性片段时为阳性；若为多态性片段或者致病性未知时为阴性。

1.4 统计学方法

以SPSS 20.0 软件行数据分析，计数资料以n（%）表示。

2 结果

高通量测序染色体核型分析共检测812 例绒毛样本，检测成功806 例，检测失败6 例，检测成功率为99.26%。绒毛染色体异常291 例，占比为36.10%，其中致病性CNV 19例，占比为2.36%；绒毛染色体未见明显异常515 例，占比为63.90%。在291 例绒毛染色体异常样本中，染色体数目异常为272 例，包括非整倍体为222 例，其中三体为178 例，主要涉及染色体16 号和22 号；单体为46 例，多数为特纳综合征43 例；三倍体为36 例；47，XXX 2 例，47，XXY 4 例，染色体结构异常为19 例。见表1。

表1 自然流产高通量测序染色体核型结果分析

3 讨论

自然流产是一种常见的妊娠期并发症，发病率呈不断上升的趋势，其中染色体异常为关键致病因素，约占自然流产或胚胎停育50%[5-6]。绒毛是胚胎组织的组成部分，其具有和胚胎组织相同的遗传性状，因此绒毛细胞所制备的染色体核型即为胎儿染色体核型。绒毛细胞及胚胎组织均是通过受精卵进行有丝分裂后而产生，绒毛细胞及胚胎组织所携带的遗传信息均相同，因此绒毛细胞及胚胎组织可作为标本来检查胚胎染色体的异常情况，从而查找到自然流产发生的病因，为临床诊治不孕不育工作提供参考依据，为胚胎停育患者的再次妊娠提供有效的遗传信息咨询[7-8]。

流产组织绒毛染色体检测的方法包括染色体核型分析和高通量测序法[9]。染色体核型分析能够检测出46 条染色体数目异常及染色体大结构异常，但该检测方法存在诸多的缺点，包括：（1）核型分析需对绒毛细胞进行培养，且检测周期较长，标本质量要求高，当标本受到污染后会导致培养失败，从而得不到正确的检测结果[10]。（2）整个检测流程均为人工操作，且对操作人员能力要求高，稳定性差[11]。（3）核型分析的分辨率不高，无法检出染色体的拷贝数变异，对5%以下嵌合的检出率较低[12-13]。绒毛染色体的细胞培养G 显带核型分析也存在不足之处，即培养时间较长，培养成功率受制于流产组织的新鲜程度及绒毛形态，且无法检测出低于5 Mb 的微小染色体畸变[14-15]。

王兰等[16]研究结果报道，高通量测序技术对流产组织行染色体核型分析显示异常率为48.90% ；异常核型以三体型为65.17%，染色体微缺失/ 微重复次之为15.73%。本研究结果显示，高通量测序染色体核型分析共检测812 例绒毛样本，检测成功806 例，检测失败6 例，检测成功率为99.26%。绒毛染色体异常291 例，占比为36.10%，其中致病性CNV 19 例，占比为2.36% ；绒毛染色体未见明显异常515 例，占比为63.90%。在291 例绒毛染色体异常样本中，染色体数目异常为272 例，包括非整倍体为222例，其中三体为178 例，主要涉及染色体16 号和22 号；单体为46 例，多数为特纳综合征43 例；三倍体为36 例；47，XXX 2 例，47，XXY 4 例，染色体结构异常为19 例。本研究结果与王兰等[16]研究结果存在共同之处。结果提示：高通量分析测序能够提高染色体结构异常的检出率。分析原因可能为：（1）高通量分析测序可调整测序深度和覆盖度，加强对染色体的亚端粒区域观察，以得到准确的判定依据，可提高自然流产胚胎组织绒毛染色体异常的检出率[17-18]。（2）高通量分析测序能够对数十万至数百万个DNA 分子进行测序，最小能够检测10 kb 微小片段异常，且无需细胞培养，可应用于流产组织绒毛染色体检测[19-20]。

综上所述，高通量分析测序检测可明确自然流产的遗传学因素。本研究的局限性在于未进行细胞培养染色体核型分析，缺少对照研究，在接下来的研究中将继续进行深入研究。文章的研究结果为进行细胞培养染色体核型分析提供了借鉴内容。