USP41促进MCF7乳腺癌细胞恶性表型的作用及机制

王 园 凌 瑞 黄美玲

乳腺癌是威胁女性健康的重要疾病，目前已超肺癌成为世界第一大癌种，寻找新型潜在有效治疗靶点对于更好地实现乳腺癌精准治疗意义重大[1]。泛素化修饰是真核生物内一种重要的蛋白翻译后修饰，蛋白泛素化和去泛素化的稳态失衡会导致细胞功能异常，包括肿瘤的发生[2, 3]。在蛋白泛素化稳态研究中，与泛素化修饰相反，细胞内也存在一类去泛素化酶，可以将泛素分子从蛋白上水解。其中泛素特异性蛋白酶(ubiquitin-specific protease, USPs)是最重要的、亚成员最多的去泛素化相关酶家族[4]。近年来研究发现，多种USPs在肿瘤中异常表达，参与肿瘤的恶性表型并和肿瘤患者的预后密切相关[5]。然而，USPs在乳腺癌中的作用及机制鲜有报道[6]。本研究探索USP41对MCF7乳腺癌细胞的作用效果及机制，旨在为促进乳腺癌化疗敏感度提供新的作用靶点，为乳腺癌个体化治疗提供新的思路。

材料与方法

1.细胞系、细胞培养及临床样本：人乳腺癌细胞MCF7购自中国科学院细胞库(上海)，细胞均经过STR分型鉴定。MCF7细胞使用含10%胎牛血清，10μg/ml胰岛素的DMEM培养基。细胞均培养于37℃、5%CO2的环境中，每3天传代一次。乳腺癌组织和癌旁组织取自空军军医大学西京医院收治的乳腺癌患者。收集组织标本后立即液氮冷冻备用。参与的患者在入组前均充分知情，本研究方案获得了空军军医大学西京医院医学伦理学委员会批准(伦理审批号：KY20213157-1)。

2.CCK-8实验：应用CCK-8法进行细胞增殖评估，取对数生长期细胞，吸尽培养液，磷酸盐缓冲液(PBS)清洗，加入1ml胰酶使其与细胞充分接触，待细胞变圆后终止反应，将细胞接种于96孔板，并在37℃、5%CO2条件下孵育过夜。待细胞贴壁，按分组处理，设复孔，孵育48h。弃原培养液，向每孔加100ml配好的CCK-8(1∶10)，溶液孵育3h，在450nm下，用酶标仪测定吸光度，每个实验重复进行3次。

3.细胞克隆实验：通过结晶紫染色进行菌落形成实验。将细胞以300个/皿的密度接种于6cm培养皿中，并在37℃、95%空气和5%CO2的加湿培养箱中孵育。两周后，用PBS清洗细胞。菌落用甲醇固定10min，0.5%结晶紫染色15min。PBS洗涤10次后，倒置显微镜(CKX53，日本Olympus公司)下可观察到明显的细胞集落。排除含有少于50个细胞的菌落。

4.Transwell：使用Transwell小室进行Transwell迁移试验。将无血清培养基中的8×104个细胞接种到小室的上室中，小室的底部为含10%FBS的DMEM培养基。孵育36h后，用甲醇固定细胞，并用Giemsa染色。然后擦去膜顶面的细胞，在倒置光学显微镜下检查下表面的细胞。在100倍放大下计数10个随机视野的细胞数量，定量迁移或侵袭细胞的数量。

5.RT-qPCR：使用TRIzol试剂(美国Invitrogen公司)分离RNA，使用SuperScript Ⅲ(美国Invitrogen公司)和polyN引物，从1μg总RNA中生成cDNA。使用StepOne和StepOne Plus实时PCR系统(美国Applied Biosystems公司)进行qPCR。使用以下公式分析数据：R=2-(ΔCt样品-ΔCt对照品，R：相对表达水平；ΔCt样本：基因Δt与平均参考之间的差异；ΔCt对照：对照样本中基因Ct与平均参考之间的差异)。

6.Western blot：收集细胞并用RIPA裂解缓冲液(100mmol/L NaCl，50mmol/L Tris-HCl pH值7.5，1%TritonX-100，1mmol/L EDTA，10mmol/L b-甘油磷酸盐，2mmol/L钒酸钠和蛋白酶抑制剂)裂解。使用micro-BCA蛋白测定法(Rockford，美国Pierce公司)测定蛋白浓度。通过12%SDS-PAGE分离40 lg蛋白/泳道，并电印迹到硝酸纤维素(德国Amersham Pharmacia公司)上。然后，用5%脱脂乳封闭膜，用抗USP41(1∶1000，美国Invitrogen公司)、RACK1(1∶1000,美国Proteintech公司)、β-actin(1∶1000,中国Servicebio公司)和GAPDH(1∶1000,美国Proteintech公司)抗体孵育。在冷藏室中用一抗孵育过夜。然后将膜与偶联山羊抗小鼠IgG(1∶5000，美国Sigma公司)的二抗孵育，并使用增强化学发光法(ECL，英国Amersham Pharmacia公司)显色。

7.CoIP-MS：CoIP-MS用于探索与USP41的相互作用蛋白：(1)细胞裂解液与抗体孵育。(2)免疫复合物与蛋白A/G琼脂糖树脂结合。(3)去除非相互作用蛋白。(4)洗脱获得蛋白相互作用复合物。(5)质谱鉴定蛋白相互作用复合物。富集的免疫共沉淀产物经质谱分析，去除评分为b20的肽，评分越高意味着与二级图谱的匹配程度越好。在UniPro中检索并定性比较肽。还评价了UniquePep计数和覆盖百分比，作为最终鉴别结果的辅助指标。

结 果

1.USP41在乳腺癌中显著高表达：USP41在乳腺癌样本及配对的癌旁检测发现，USP41在癌组织中的表达显著高于癌旁组织(图1)。

2.USP41促进MCF7细胞增殖：为探索USP41对MCF7细胞的作用，笔者研究过表达及敲减USP41(图2中A、B)。细胞增殖实验发现USP41过表达显著促进MCF7细胞增殖(图2C)，USP41敲减后抑制细胞增殖(图2D)。

图2 USP41促进MCF7细胞增殖

3.USP41过表达促进MCF7细胞克隆形成：克隆形成实验发现，USP41过表达显著促进MCF7细胞克隆形成，USP41敲减后抑制细胞克隆形成(图3)。

4.USP41过表达促进MCF7细胞迁移：细胞迁移实验发现，USP41过表达显著促进MCF7细胞迁移，USP41敲减后抑制细胞迁移(图3中C、D)。

图3 USP41促进MCF7细胞生长与迁移

5.USP41过表达抑制MCF7细胞凋亡：流式细胞仪测细胞周期与凋亡发现，USP41过表达显著抑制MCF7细胞凋亡，USP41敲减后促进细胞凋亡(图4中A、B)。细胞周期检测发现，USP41可阻滞MCF7细胞于G0/G1期(图4中C、D)。

图4 USP41抑制细胞凋亡以及阻滞细胞周期

6.USP41与RACK1直接相互作用：CoIP-MS检测发现一系列可以与USP41直接作用的分子。LC-MS/MS下机后，将原始数据提交到质谱仪连接的Proteinpilot软件进行检索，过滤掉常见污染蛋白及与之匹配的肽段。最终得到FC>1.5的150个相互作用的分子。通过查阅文献，笔者研究锁定了10个可能有价值的分子。本研究针对其中的RACK1分子进行功能验证。研究发现，相较于癌旁组织，RACK1在乳腺癌组织中明显上调(图5)。

图5 USP41可能通过RACK1发挥作用

7.USP41通过RACK1发挥作用：抑制USP41表达发现RACK1表达显著下调(图6A)，抑制RACK1可使MCF7的细胞克隆形成能力明显下降(图6B)，细胞迁移能力亦显著降低(图6C)。过表达USP41，同时敲低RACK1发现(图6D)，USP41促进MCF7生长、克隆形成和迁移的能力显著下降(图6中E～G)，提示USP41可通过RACK1发挥促癌作用。

图6 USP41通过RACK1发挥作用

讨 论

USPs可以通过去泛素化稳定多个癌基因，促进乳腺癌的进展和耐药。Giovinazzi等[7]研究发现，USP7可调节有丝分裂关键调控分子促进乳腺癌的进展和对紫杉烷的耐药。Soyeon等[8]在乳腺癌中发现USP8可通过去泛素化稳定Notch1蛋白，进而促进乳腺癌的发生、发展。USP3在乳腺癌中高表达并与不良预后相关[9]。此外，USPs在不同乳腺癌类型中的表达存在差异，例如USP21在三阴性乳腺癌中表达显著高于其他亚型[10]。USP41是USPs家族排名第41位成员，位于22号染色体长臂二区二带。目前对USP41的研究相对较少，在TNBC中的作用更是鲜见报道。本研究发现，USP41在乳腺癌中显著上调并参与调控MCF7细胞恶性表型，为促进乳腺癌新型分子标志物的探索及开发针对性靶向药物提供参考。

多功能支架蛋白RACKl是肿瘤细胞转移的必要蛋白，包含Trp-Asp (WD)重复蛋白家族，是有核细胞的信号转导中枢，锚定在特定亚细胞位置[11]。RACK1可结合并调节蛋白激酶C(protein kinase C,PKC)活性，参与多种细胞内信号通路。RACK1在不同癌种中可能发挥不同的功能，既发挥“抑癌基因”的角色，又具备“原癌基因”功能[12,13]。Fan等[14]研究发现RACK1可明显促进乳腺癌细胞的增殖能力。与本研究结果一致，干扰RACK1可以显著抑制乳腺癌细胞增殖能力，提示RACK1对MCF7的恶性表型具有重要调节作用。因此，探讨RACK1在细胞内蛋白稳定性如何调节可能是抑制乳腺癌恶性表型的另一个潜在方式。

与乳腺癌相关的USPs调节的信号通路更像是转化生长因子β(transforming growth factor-β，TGF-β)信号通路，其在介导上皮-间充质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)、肿瘤进展和转移方面具有有据可查的作用[15]。Eichhorn等[16]研究显示，USP15稳定了TGF-β受体ⅰ，并通过激活TGF-β信号促进了肿瘤的发生。2019年，张军等[17]研究证明，USP4抑制阻止了TGF-β/Smad信号通路的活性。本研究发现USP41与RACK1相关。而RACK1被确定为TGF-β1的伴随调节因子[18]。RACK1可以通过抑制TGF-β1/Smad信号通路来抑制瘢痕成纤维细胞中胶原的合成[19]。RACK1沉默被证明通过抑制TGF-β信号转导来减轻肾纤维化[20]。最重要的是，USP41可能通过与RACK1结合，通过TGF-β信号转导发挥致癌作用。然而，RACK1调节乳腺癌的机制广泛多样。还需要进一步的研究来探索其在USP41介导的乳腺癌进展中的作用。

综上所述，USP41在乳腺癌中显著上调，与促进MCF7恶性表型相关，并可能通过上调RACK1表达发挥作用。