miR-181b-5p负调控CYLD的表达促进膀胱癌细胞增殖、迁移和侵袭

朱 奕 李世豪 刘宏伟

膀胱癌(bladder cancer，BCa)是人类泌尿生殖系统最常见的恶性肿瘤之一[1]。2020年全球癌症数据显示，BCa新发病例约573000例，死亡病例约213000例[2]。高龄、吸烟、感染、接触致癌物和部分职业暴露等均是BCa发生的危险因素[3]。BCa的发生、发展是一个多因素、多阶段、多机制的过程，其发病机制尚未完全阐明。目前针对BCa的治疗包括手术治疗、放化疗、免疫治疗等，但总体治愈率仍不理想[4, 5]。因此，了解BCa发生的分子机制，发掘其潜在的治疗靶点对BCa的临床治疗至关重要。

microRNA(miRNA)是一类长度约为20～23个核苷酸的内源性小RNA，在调节肿瘤细胞生长、增殖、分化、凋亡和代谢等方面发挥重要作用[6,7]。miR-181b-5p在多种肿瘤中异常表达，并且在不同的肿瘤中表现出双重特性，既可以作为癌基因，也可以作为抑癌基因。例如，miR-181b-5p在非小细胞肺癌和乳腺癌中表达均上调，具有成为肺癌和乳腺癌诊断标志物的潜力[8, 9]。miR-181b-5p在脑胶质瘤细胞中表达下调，作为抑癌miRNA靶向下游Bcl-2基因，增强胶质瘤对替莫唑胺的化疗敏感度[10]。这表明miR-181b-5p在调节肿瘤发生、发展中的作用具有组织特异性，然而miR-181b-5p在BCa中的作用尚未阐明。

抑癌基因Cylindromatosis(CYLD)是 USP 去泛素化酶家族的成员，其翻译产物是一种去泛素化酶，具有从特定底物中去除多聚泛素链的强大能力，能够通过去泛素化调控Wnt/β-catenin、TGF-β、NF-κB和JNK等信号通路[11]。CYLD突变或表达失调是包括癌症在内的多种疾病发生的重要因素。例如，CYLD的表达在鼻咽癌组织和细胞中均显著降低，过表达CYLD能够通过泛素-蛋白酶体途径抑制抑癌因子NDRG1泛素化和降解，上调NDRG1水平，抑制鼻咽癌的进展[12]。研究表明，通过小干扰 RNA沉默CYLD或促癌 miRNA 下调 CYLD的表达，胃癌、膀胱癌、肺癌、结直肠癌等多种癌细胞迁移和转移能力增加[11]。

本研究探讨miR-181b-5p在BCa细胞中的作用及对CYLD的靶向调控作用，期待为BCa治疗提供新的靶点。

材料与方法

1.细胞株及实验材料：人膀胱尿路上皮癌细胞株(T24、UM-UC-3、5637)和人膀胱上皮永生化细胞(SV-HUC-1)购自中国科学院细胞库(上海)；RPMI-1640培养基、DMEM培养基和胎牛血清购自美国Gibco公司；miR-181b-5p 模拟物和CYLD siRNA由苏州吉玛基因股份有限公司设计合成。miR-NC sense：5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3′，miR-NC antisense： 5′-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3′；miR-181b-5p模拟物 sense：5′-AACAUUCAUUGCUGUCGGUGGGU-3′，miR-181b-5p模拟物 antisense：5′-CCACCGACAGCAAUGAAUGUUUU-3′；si-CYLD-1 sense：5′-GGGCUUGCAAUGUAUGAGUTT-3′，si-CYLD-1 antisense：5′-ACUCAUACAUUGCAAGCCCTT-3′；si-CYLD-2 sense：5′-GGUUCAUCCAGUCAUAAUATT-3′，si-CYLD-2 antisense：5′-UAUUAUGACUGGAUGAACCTT-3′；Lipofectamine RNAimax转染试剂购自美国Invitrogen公司；Opti-MEM培养基购自美国Thermo Fisher公司；Transwell小室购自美国Corning公司；CCK-8试剂盒购自日本Dojindo公司；RNAiso Plus，PrimeScript反转录试剂盒和TB Green premix Ex Taq试剂盒购自日本TaKaRa公司。miRNA荧光定量PCR试剂盒购自生工生物工程(上海)股份有限公司。Dual-LumiTM双荧光素酶报告基因检测试剂盒和SDS-PAGE凝胶快速配制试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司，CYLD和GAPDH抗体购自美国Proteintech公司。

2.细胞培养与转染：T24、5637和UM-UC-3细胞在含有10%胎牛血清、1%青霉素-链霉素溶液的RPMI-1640或DMEM培养基中培养，SV-HUC-1细胞在含有10%胎牛血清、1%青霉素-链霉素的F-12K培养基中培养。放置于5% CO2浓度、37℃的恒温培养箱内，待细胞处于生长对数期进行实验。转染前1天，将T24和UM-UC-3细胞铺于6孔板内，每孔2×105个。待次日细胞生长融合至孔板面积70%～80%，按照转染试剂说明书进行转染，分为对照组和miR-181b-5p组以及对照组、CYLD-1组、CYLD-2组。

3.RNA提取和qRT-PCR：将T24、UM-UC-3、5637和SV-HUC-1细胞铺于6孔板内，24h后提取各细胞系的总RNA并测定浓度。在T24和UM-UC-3细胞中分别转染对照组、miR-181b-5p组和CYLD-1组、CYLD-2组，24h后提取各组的总RNA并测定浓度，按照反转录试剂盒说明书将总RNA反转录合成cDNA。miRNA定量PCR检测所需引物采用加尾法设计，miR-181b-5p上游引物：5′-AACATTCATTGCTGTCGGTGGGT-3′，下游引物序列由生工生物工程(上海)股份有限公司提供。内参U6上游引物：5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，U6下游引物：5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′；CYLD上游引物：5′-GCCTCCCAAACTTGCCTTTA-3′，CYLD下游引物：5′-TGGATTGTGGTTGTGAGTCAA-3′；GAPDH上游引物：5′-GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT-3′，GAPDH下游引物：5′- GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG-3′，引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。实时荧光定量PCR结果采用2-ΔΔCt统计分析。

4.CCK-8实验：转染24h后，待T24和UM-UC-3细胞处于生长对数期，将各组细胞消化离心后重新悬浮为单个细胞，以每孔1×103个细胞接种于96孔板内，每组设置3个复孔，放置于5% CO2浓度、37℃的恒温培养箱内培养。在第0～5天同一时间点向每孔加入10μl CCK-8试剂，然后继续在培养箱内放置2h，使用酶标仪检测波长为450nm时各孔的吸光度(A)值，Graphpad prism 8软件绘制细胞增殖曲线。

5.克隆形成实验：转染24h后，待T24和UM-UC-3细胞处于生长对数期，将各组细胞胰酶消化离心后重新悬浮为单细胞，以每孔500个细胞接种于6孔板内，每组设置3个复孔，放置于5% CO2浓度、37℃的恒温培养箱内培养7～10天。期间多次观察，待细胞集落形成，吸掉旧培养基，多聚甲醛固定、结晶紫染色，放在自来水下缓慢冲洗掉结晶紫，等待6孔板自然干燥后拍照。

6.Transwell迁移实验：取转染24h后处于对数生长期的T24和UM-UC-3细胞，胰酶消化细胞并用无血清培养基重悬后计数，在24孔板下室中加入600μl血清浓度为10%的完全培养基，将Transwell小室放置于24孔板内，小室内加入200μl的细胞重悬液，每个小室8×104个细胞，然后置于培养箱中培养。T24和UM-UC-3细胞分别培养约18h和24h后将小室用多聚甲醛固定和结晶紫染色，然后放在自来水下缓慢冲洗小室，待小室干燥后在显微镜下随机选取3个视野拍照并计数。

7.Transwell侵袭实验：将冻存于-80℃的基质胶提前取出放置于4℃解冻。次日，按照基质胶和无血清培养基1∶5的比例配成稀释液，将Transwell小室放在24孔板内，吸取50μl基质胶稀释液铺于小室内，置于培养箱内2～3h使之凝固。凝固后在下室加入600μl完全培养基，小室内加入200μl细胞重悬液，每个小室8×104个细胞。置于培养箱中继续培养相应时间后取出，后续固定、染色步骤同上。

8.双荧光素酶报告基因实验：采用starbase在线数据库预测miR-181b-5p潜在的靶基因CYLD以及结合位点，构建CYLD 3′-UTR双荧光素酶野生型质粒wt-CYLD和突变型质粒mut-CYLD。将wt-CYLD和mut-CYLD与miR-181b-5p 模拟物和对照共转染T24和UM-UC-3细胞。转染24h后吸尽旧培养基，用PBS清洗细胞3次，然后按照说明书加入细胞裂解液，充分裂解后，取20μl样品，加入100μl萤火虫荧光素酶检测试剂，混匀后室温孵育5min，然后使用多功能酶标仪进行化学发光检测，再加入100μl海肾荧光素酶检测试剂，混匀后进行酶标仪化学发光检测，根据测得值进行双荧光素酶报告基因实验后续分析。

9.Western blot法检测：转染48h后，提取对照组和miR-181b-5p组的总蛋白质并测定浓度，30μg蛋白加入SDS-PAGE凝胶孔中，电泳2h后转移至PVDF膜，5%脱脂奶封闭1h，并在4℃条件下孵育一抗(CYLD抗体稀释浓度为1∶1000，GAPDH抗体稀释浓度为1∶10000)过夜。次日孵育二抗1h，然后进行化学发光与曝光，以GAPDH为内参，用Image-J软件分析各组灰度值。

结 果

1.miR-181b-5p在膀胱上皮永生化细胞和BCa细胞中的表达情况：qRT-PCR检测miR-181b-5p在SV-HUC-1细胞和T24、5637、UM-UC-3细胞中的表达水平。结果显示，与SV-HUC-1比较，miR-181b-5p在T24、5637、UM-UC-3细胞中的表达水平明显升高(P<0.05，图1)。

图1 miR-181b-5p在膀胱上皮永生化细胞和膀胱癌细胞中的表达水平

2.过表达miR-181b-5p促进BCa细胞增殖、迁移和侵袭：转染miR-181b-5p 模拟物后，qRT-PCR验证转染效率。结果显示，在T24和UM-UC-3细胞中，与对照组比较，miR-181b-5p组miR-181b-5p的表达水平显著升高，差异有统计学意义(P<0.01，图2A)，提示转染成功。CCK-8检测过表达miR-181b-5p后对T24和UM-UC-3细胞增殖能力的影响，结果显示，miR-181b-5p组的细胞增殖能力显著高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05，图2中B、C)。细胞克隆形成实验结果显示，miR-181b-5p组的细胞集落数显著多于对照组，差异有统计学意义(P<0.05，图2中D、E)，表明过表达miR-181b-5p后，T24和UM-UC-3细胞的增殖能力显著增强。Transwell迁移和侵袭实验显示，与对照组比较，miR-181b-5p组的细胞迁移和侵袭数目均增加，差异有统计学意义(P<0.05，图2中F～I)。

图2 过表达miR-181b-5p对BCa细胞增殖、迁移和侵袭的影响

3.miR-181b-5p与CYLD 3′-UTR结合负调控CYLD的表达：利用starbase在线数据库预测miR-181b-5p与CYLD的3′-UTR含有互补的核苷酸序列(图3A)，随后构建了CYLD 3′-UTR双荧光素酶野生型质粒wt-CYLD和突变型质粒mut-CYLD。双荧光素酶报告基因实验结果显示，在T24和UM-UC-3细胞中，与对照组+wt-CYLD组比较，miR-181b-5p组+wt-CYLD组的荧光素酶活性显著降低，差异有统计学意义(P<0.05，图3B、C)。然而，miR-181b-5p组+mut-CYLD组的荧光素酶活性相较于对照组+mut-CYLD组无明显变化(P>0.05)，提示miR-181b-5p 与CYLD 3′-UTR之间存在结合位点。为进一步验证miR-181b-5p调控CYLD的表达水平，qRT-PCR结果显示，与对照组比较，miR-181b-5p组的CYLD mRNA水平显著降低，差异有统计学意义(P<0.05，图3D)。Western blot法实验结果显示，miR-181b-5p组的CYLD蛋白表达量较对照组显著降低，差异有统计学意义(P<0.01，图3中E、F)。以上实验结果表明，miR-181b-5p对靶基因CYLD有负性调控作用。

图3 miR-181b-5p对靶基因CYLD的影响

4.沉默CYLD促进BCa细胞增殖、迁移和侵袭：沉默CYLD后，采用qRT-PCR验证转染效率。结果显示，与对照组比较， CYLD-1组和CYLD-2组的CYLD表达水平显著降低，差异有统计学意义(P<0.01，图4A)，提示沉默CYLD转染成功。CCK-8结果显示，沉默CYLD显著促进膀胱癌T24和UM-UC-3细胞增殖，差异有统计学意义(P<0.05，图4中B、C)。细胞克隆形成实验结果显示，与对照组比较，CYLD-1组和CYLD-2组细胞集落形成数目增多，差异有统计学意义(P<0.05，图4中D～F)。Transwell迁移和侵袭实验显示，与对照组比较，CYLD-1组和CYLD-2组的细胞迁移和侵袭数目均增加，差异有统计学意义(P<0.01，图4中G～J)。以上结果表明沉默CYLD能够促进BCa细胞的增殖、迁移和侵袭能力。

图4 沉默CYLD对BCa细胞增殖、迁移和侵袭能力的影响

讨 论

BCa是泌尿生殖系统最常见的恶性肿瘤之一，尽管近些年BCa的发生率和病死率呈下降趋势，但仍严重威胁人们的生命健康[13]。随着对BCa分子生物学的认识不断提高，人们发现miRNA与BCa的发生、发展密切相关，以期从分子水平阐释BCa的发病机制[14]。研究表明miRNA参与BCa的增殖、迁移、侵袭、远处转移和耐药等多种生物学过程，甚至认为miRNA可作为BCa早期诊断和预后评估的重要标志物[15, 16]。研究发现，miR-181b-5p在胃癌患者血清和胃癌细胞中表达升高，下调miR-181b-5p的表达后可显著抑制胃癌细胞的增殖[17]。此外，miR-181b-5p在非小细胞肺癌、乳腺癌、胆管癌、脑胶质瘤和结直肠癌中均有不同程度的异常表达[8～10,18,19]。然而，miR-181b-5p在BCa中的作用和机制尚不明确。

本研究比较了膀胱上皮永生化细胞和BCa细胞中miR-181b-5p的表达水平，结果显示，miR-181b-5p在BCa细胞中的表达量显著升高，表明miR-181b-5p可能参与了BCa的发生、发展。随后，本研究进一步探讨了miR-181b-5p在BCa中的生物学作用，采用体外转染法过表达miR-181b-5p后，可显著增加T24和UM-UC-3细胞的增殖、迁移和侵袭能力，表明miR-181b-5p在BCa中发挥明显的促癌作用。miRNA通过碱基互补配对的方式结合到靶基因的3′-UTR，导致靶基因降解或翻译抑制[20～22]。本研究采用生物信息网站starbase数据库预测CYLD是miR-181b-5p的潜在靶基因。双荧光素酶报告基因实验证实miR-181b-5p能够与CYLD的3′-UTR结合，过表达miR-181b-5p后在mRNA和蛋白质水平抑制CYLD的表达，进一步证明CYLD是miR-181b-5p的靶基因。

CYLD是一种去泛素化酶，在多种癌症中属于肿瘤抑制基因，其抑癌功能的丧失与胃癌、肺癌、结直肠癌和多发性骨髓瘤等多种肿瘤的发生相关[11, 23]。研究表明，CYLD在BCa组织和细胞系中的表达均下降，过表达CYLD后通过NF-κB信号通路抑制BCa细胞的增殖、迁移和细胞周期S期的聚集[24]。本研究发现沉默CYLD的表达后，BCa细胞的增殖、迁移和侵袭能力显著增加，表明CYLD在BCa中起着抑癌基因的作用。

综上所述，miR-181b-5p在BCa细胞系中表达下调，通过负调控CYLD的表达促进BCa细胞的增殖、迁移和侵袭。本研究在一定程度上阐述了miR-181b-5p与BCa发生、发展之间的关系，表明miR-181b-5p可能成为BCa治疗的新靶点。