miR-486-3p靶向DDR1对口腔鳞状细胞癌的抑制作用及槟榔致口腔鳞状细胞癌的可能机制▲

唐乃高 郑根建

(海南医学院第一附属医院口腔科，海南省海口市 570100)

2020年，全球唇及口腔癌的新发病例数约377 713例，死亡病例数约177 757例[1]。口腔鳞状细胞癌(oral squamous cell carcinoma, OSCC)是最常见的口腔癌病理类型。手术治疗、放化疗及靶向治疗是OSCC的常见治疗手段，这些方法均具有一定的疗效，但在改善OSCC患者预后方面效果欠佳[2]。酒精、槟榔和香烟是OSCC最常见的致病因素[3]，其中咀嚼槟榔被公认为是导致OSCC的最主要因素[4]。了解咀嚼槟榔所致的OSCC临床特征，对于寻找OSCC的新治疗靶点和改善患者预后具有重要意义。

研究显示，miR-486-3p在急性冠状动脉综合征、银屑病、高血压和代谢综合征等多种疾病中发挥重要作用[5-7]。 miR-486-3p还可以通过抑制多种癌细胞的迁移和侵袭，发挥肿瘤抑制作用[8]，如miR-486-3p通过靶向细胞外基质蛋白1抑制视网膜母细胞瘤的增殖、迁移和侵袭，以及宫颈癌细胞的增殖和转移[9-10]。盘蛋白结构域受体-1(discoidin domain receptor-1，DDR1)是盘蛋白结构域受体亚家族的成员，属于受体酪氨酸激酶(receptor tyrosine kinase,RTK)家族，在基质重塑、胶原蛋白的产生和降解、细胞增殖、细胞分化及细胞黏附等多种细胞功能中发挥着关键的作用[11]。已有文献报告DDR1在肺癌[12]、乳腺癌[13]、脑癌[14]、口腔癌[8]和肝癌[15]等多种人类肿瘤中异常表达及被激活。本研究探讨miR-486-3p通过靶向DDR1抑制嚼槟榔所致OSCC的作用机制，以期为临床上治疗OSCC提供新思路。

(2)邀请老党员参加一个或几个学生支部“三会一课”，加强对学生党员组织生活的指导，讲好党课，做好党建重点任务，并计划扩展到邀请校内外有丰富经验的老党务工作者。

1 材料与方法

1.1 主要材料

1.1.1 实验细胞：人口腔表皮癌(oral epidermal carcinoma,OEC)-M1细胞系，正常口腔角质形成细胞系OKF4/TERT-1，以及用于荧光素酶实验的工具细胞—人胚胎肾细胞系HEK293，均购自中国科学院上海细胞库。

1.1.2 实验试剂：EdU细胞增殖试剂盒(江苏凯基生物技术股份有限公司，批号：KGA331-1000)；反转录试剂盒(Invitrogen公司，批号：11750150)；甘氨酸(江苏凯基生物技术股份有限公司，批号：G274229)；Hoechst染色试剂盒(Bioworld公司，批号：33342)；QuantiTect SYBR Green试剂盒(TaKaRa公司，批号：RR820A)；TRIzol试剂盒(TaKaRa公司，批号：108-95-2)；pmirGLO萤火虫荧光素酶表达载体(Addgene公司，批号：117339)；双荧光素酶报告基因检测系统(30IOC化学发光测试仪，Progema公司)；定点诱变试剂盒(TaKaRa公司，批号：R401)；LipofectamineTM2000转染试剂盒(Thermo Fisher Scientific公司，批号：11668500)；二喹啉甲酸蛋白浓度测定试剂盒(TaKaRa公司，批号：T9300A-3)；蛋白marker(Thermo Fisher Scientific公司，批号：26617)；胎牛血清(BI公司，批号：04-010-1ACS)；DMEM(Gibco公司，批号：10-013-CVR)；Opti-MEM(Gibco公司，批号：31985-062)；青霉素链霉素混合液(江苏凯基生物技术股份有限公司，批号：KGY0023)；DDR1抗体(ABclonal公司，批号：A10487)、Caspase-3抗体(ABclonal公司，批号：A2156)、活化型Caspase-3(cleaved Caspase-3)抗体(ABclonal公司，批号：A2931)、GAPDH抗体(ABclonal公司，批号：A19056)；辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG抗体(Jackson公司，批号：111-035-003)；Triton X-100(Solarbio公司，批号：T8200)；T4连接酶(Sigma-Aldrich公司，批号：D2886)；Polybrene试剂(上海懋康生物科技有限公司，批号：GM-040901A)。所有PCR引物由生工生物工程(上海)股份有限公司和广州锐博生物技术有限公司合成；miR-486-3p mimic、miR-486-3p inhibitor、OE-DDR1慢病毒质粒及sh-DDR1慢病毒质粒均由生工生物(上海)股份有限公司合成；慢病毒包装质粒(psPAX2、PMD2.G)由Addgene公司合成。槟榔碱(纯度98%，Acros Organics公司，批号：300-08-3)。

1.2 方法

2.2 miR-486-3p对OSCC细胞增殖和凋亡相关蛋白表达水平的影响 与对照1组相比，miR-486-3p mimic组OEC-M1细胞EdU阳性细胞比例降低，cleaved Caspase-3蛋白表达水平升高，而miR-486-3p inhibitor组OEC-M1细胞EdU阳性细胞比例增高，cleaved Caspase-3蛋白表达水平降低(均P<0.05)。3组的Caspase-3蛋白表达水平差异无统计学意义(P>0.05)。见表1、图1。

1.2.2 细胞培养及转染

1.2.2.1 细胞培养：OEC-M1细胞、OKF4/TERT-1细胞、HEK293细胞均培养于含10%胎牛血清及1%青霉素链霉素混合液的DMEM中，置于37 ℃、5% CO2细胞培养箱培养中。

1.2.2.2 瞬染：取对数生长期OEC-M1细胞，用胰酶消化后接种于6孔细胞培养板(接种密度为1×106个/孔)，待细胞生长融合至80%后，严格按照LipofectamineTM2000转染试剂盒说明书进行转染操作。将细胞分为3组进行干预：对照1组，常规培养细胞，不给予任何特殊处理；miR-486-3p mimic组，给予50 nmol/L的miR-486-3p mimic处理48 h；miR-486-3p inhibitor组，给予100 nmol/L的miR-486-3p inhibitor处理48 h。各组细胞均培养于37 ℃、5% CO2孵育箱中。

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二是依申请信息公开标准化。制定落实政务信息主动公开制度，公开了财政部门预决算、政府性基金和行政事业性收费目录、规范性文件、财政政策等信息，推进部门预决算和“四本预算”全公开。完善内部工作流程和法定程序，制定《财政政府信息依申请公开标准化管理》，规范答复格式文书，将答复流程嵌入办公自动化。

“填词首重音律，而予独先结构”，李渔的戏剧创作非常重视结构，与承自西方小说体系的现当代小说创作中的“结构”概念不同，李渔所说的结构，其实是在强调行文的紧密性，他认为戏剧的创作应该“立主脑”且“密针线”。

1.2.3 实时荧光定量PCR：收集组织(组织采用捣碎器进行捣碎)及各组细胞，采用TRIzol法提取总RNA，然后将RNA进行反转录得到cDNA。使用PCR仪扩增miR-486-3p及内参U6。扩增体系为2×miRcute mirRNA premix 10 μL+反转录引物0.2 μL+miR-486-3p/U6上下游引物各0.5 μL+cDNA 1.0 μL+RNase Free H2O 7.8 μL，共计20 μL。反应条件为94 ℃ 2 min，1个循环；94 ℃ 20 s，40个循环；72 ℃ 10 min。miR-486-3p上游引物序列为5′-GAGTGTCGGGGCAGCTCAGT-3′，下游引物序列为5′-GCAGGGTCCGAGGTATTC-3′；U6上游引物序列为5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，下游引物序列为5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。使用PCR仪扩增DDR1及内参GAPDH，扩增体系为SYBR Premix Ex TaqTMⅡ 12.5 μL+DDR1/GAPDH上下游引物各1 μL+cDNA 2 μL+RNase Free H2O 8.5 μL，共25 μL。反应条件为95 ℃预变性30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，总循环40次；73 ℃延伸5 min。DDR1上游引物序列为5′-GTTCCTGGCGGATGATG-3′，下游引物序列为5′-GGGAATGGGCAAGTATGG-3′；GAPDH上游引物序列为5′-ATGACATCAAGAAGGTGGTG-3′，下游引物序列为5′-CATACCAGGAAATGAGCTTG -3′。采用2-ΔΔCt法计算miR-486-3p、DDR1 mRNA的相对表达水平。实验重复3次。

1.2.4 EdU染色：用DMEM(含10%胎牛血清及1%青霉素链霉素混合液)按1 000 ∶1的比例稀释EdU A液，以制备50 μmol/L EdU培养基。取对数生长期各组细胞，每孔加入100 μL的50 μmol/L EdU培养基，孵育2 h后弃培养基，用PBS轻洗3次，5 min/次。每孔加入100 μL细胞固定液(即含4%多聚甲醛的PBS)，室温孵育30 min后弃固定液，用PBS轻洗3次，5 min/次。采用0.5% Triton X-100室温破膜20 min，PBS轻洗3次，5 min/次。每孔加入200 μL的2 mg/mL甘氨酸，在脱色摇床上孵育5 min后弃甘氨酸溶液，用PBS轻洗3次，5 min/次。每孔加入100 μL的1×Appollo染色反应液，避光、室温下在脱色摇床上孵育30 min，弃染色反应液。每孔加入100 μL甲醇轻洗2次，5 min/次。用去离子水按100 ∶1的比例稀释制备1×Hoechst反应液，避光孵育20 min，弃1×Hoechst反应液，用PBS轻洗3次，5 min/次。使用荧光显微镜(Leica公司，型号：DM2500)进行观察，阳性细胞在显微镜下呈绿色。每组随机选取10个视野，计算每个视野下阳性细胞占总细胞的比例，取平均值为该组EdU阳性细胞比例，用于表示细胞增殖能力。实验重复3次。

建设富裕文明的美丽宜居名城。突出优质均等抓好民生大事、人文关怀解决关键小事，把就业、教育、医疗、养老、社保、住房、家政服务等问题一个一个解决好、一件一件办好，普遍增加群众“隐性财富”。以时不我待的紧迫感构建立体化现代综合交通运输体系，高标准实施“水气土”专项治理，让城乡融合发展呈现新形态。

1.2.5 生物信息学分析：采用TargetScan数据库(https://www.targetscan.org/vert_80/)进行miR-486-3p与DDR1的预测位点分析。首先输入miR-486-3p，然后以|log2FC|≥2且P<0.05作为筛选条件，找到DDR1基因，点击DDR1基因即可显示miR-486-3p与DDR1基因的结合位点。

1.2.2.3 稳转：(1)取对数生长期HEK293细胞，用胰酶消化后接种于6孔细胞培养板(接种密度为1×106个/孔)，待细胞生长融合至80%后进行转染操作。严格按照LipofectamineTM2000转染试剂盒说明书，将2 μg OE-DDR1慢病毒质粒+1.6 μg psPAX2+2.4 μg PMD2.G转染至HEK293细胞，放入37 ℃、5% CO2细胞培养箱中继续培养，48 h后以1 000 r/min离心10 min，取上清液(即病毒液)，并保存于-20 ℃冰箱待用。(2)取对数期OEC-M1细胞，用胰酶消化后接种于6孔细胞培养板(接种密度为1×106个/孔)，并分为对照2组、OE-DDR1组、sh-DDR1组。待细胞生长融合至80%后，弃去原细胞培养基，对各组细胞进行干预。将2 mL DMEM(含10%胎牛血清+1%青霉素链霉素混合液)+1 mL病毒液(加入先前融化的病毒液)+1 μL Polybrene试剂加入OE-DDR1组6孔细胞培养板中，构建OE-DDR1-OEC-M1稳转株；按照上述方法对sh-DDR1组细胞构建sh-DDR1-OEC-M1稳转株；对照2组细胞正常培养，不进行干预。

2.3 DDR1对OSCC细胞增殖和凋亡相关蛋白表达水平的影响 与对照2组相比，sh-DDR1组OEC-M1细胞EdU阳性细胞比例降低，cleaved Caspase-3蛋白表达水平升高，而OE-DDR1组OEC-M1细胞EdU阳性细胞比例升高，cleaved Caspase-3蛋白表达水平降低(均P<0.05)。3组的Caspase-3蛋白表达水平差异无统计学意义(P>0.05)。见表2、图2。

1.2.7 Western blot检测：使用蛋白裂解液提取各组细胞的总蛋白，4 ℃下3 000 r/min离心30 min，弃沉淀，保留上清液，采用二喹啉甲酸法进行蛋白定量。各组取5 μg的蛋白上清液，加入10 μL 5×蛋白上样缓冲液并于金属浴中加热变性5 min。十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺分离胶及浓缩胶配置完成后，加入7 μL的蛋白样品进行电泳。待电泳结束后，以300 mA恒流进行湿转转膜，将蛋白转型PVDF膜后，5%脱脂牛奶于室温下封闭PVDF膜2 h后，TBST洗膜3次，5 min/次。加入稀释后的Caspase-3抗体(1 ∶1 000)、cleaved Caspase-3抗体(1 ∶1 000)、DDR1抗体(1 ∶1 000)、GAPDH抗体(1 ∶1 000)，4 ℃摇床孵育过夜。TBST溶液清洗3次，5 min/次，加入辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG(1 ∶5 000)室温振荡1 h，TBST溶液清洗3次，5 min/次。最后均匀滴加电化学发光液，于凝胶成像仪进行曝光拍照。采用Image J软件测定条带灰度值，以目标蛋白与内参GAPDH灰度值的比值作为目标蛋白的相对表达水平。实验重复3次。

通过思想政治理论课教学能使教师自身的教学指导能力与科研能力得到不断提高；促使教师更加全面、深入地接触和了解社会，拓宽了教师的视野，以便他们能够寻找更具有价值的科研和教研课题，进一步增强广大高校教师的科研意识，全面提高他们的科研能力。目前，我们的许多思想政治课教师只做到了“教书”，却忽视了“育人”。而在理论课教学过程中，教师不仅能够在教学中发现问题，还能够根据学生的反馈不断地完善自身的教育教学，继而明确教学的方向，加快创新步伐，并最终切实地提高思想政治理论课教学的实效性。

1.2.2.4 槟榔碱干预OKF4/hTERT细胞的方法：取生长融合至80%的OKF4/hTERT细胞，接种于24孔细胞培养板，将细胞随机分为无槟榔碱组和槟榔碱组，无槟榔碱组常规培养细胞，不给予任何特殊处理；槟榔碱组给予100 μmol/L的槟榔碱连续刺激细胞5 d。

1.3 统计学分析 采用SPSS 20.0和GraphPad Prism 8.0软件进行统计学分析。计量资料以(x±s)表示，多组间比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用LSD-t检验，两组间比较采用两独立样本t检验。以P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结 果

2.1 miR-486-3p在OSCC组织中的表达情况 癌旁组织中的miR-486-3p相对表达水平为(1.08±0.21)，OSCC组织中miR-486-3p相对表达水平为(0.48±0.17)，后者低于前者(t=9.931，P<0.001)。

1.2.1 OSCC组织标本的获取：收集20例原发性OSCC患者的肿瘤组织及癌旁组织(距离肿瘤病灶2 cm的组织)，保存于液氮中备用。患者及其家属已签署知情同意书。本研究已经过海南医学院第一附属医院人体实验和伦理委员会的审查和批准。

图1 miR-486-3p对OSCC细胞增殖和凋亡相关蛋白表达的影响

1.2.6 双荧光素酶实验：将包含miR-486-3p靶序列的DDR1片段的整个3端非翻译区(3′ untranslated region,3′UTR)进行PCR扩增。扩增体系为25 μL 2×rTaq酶+1 μL cDNA+1 μL 10 μmol/L引物+23 μL灭菌水，共50 μL。扩增条件为95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，40个循环；4 ℃保存。上游引物序列为5′-GTGATGGAGATGGGGCTT-3′，下游引物序列为5′-TCGGGAGAACTCTTTGCC-3′。使用T4连接酶将扩增后的片段克隆到pmirGLO萤火虫荧光素酶表达载体中，构建DDR1-3′UTR-WT载体，在此基础上使用定点诱变试剂盒，构建miR-486-3p与DDR1的结合位点点突变载体(DDR1-3′UTR-MUT)，并进行DNA测序验证。将OEC-M1细胞分为DDR1-3′UTR-WT+miR-486 3p-mimic组、DDR1-3′UTR-MUT+miR-486-3p mimic组，使用LipofectamineTM2000转染试剂将上述载体和20 μmol/L miR-486-3p mimic转染至两组OEC-M1细胞中。同时设立DDR1-3′UTR-WT+对照1组，只转染DDR1-3′UTR-WT载体。48 h后采用双荧光素酶报告基因检测系统检测各组细胞的荧光素酶活性。实验重复3次。

表2 DDR1对OSCC细胞增殖和凋亡相关蛋白相对表达水平的影响(x±s)

图2 DDR1对OSCC细胞增殖和凋亡相关蛋白表达的影响

2.4 miR-486-3p在OSCC中靶向调控DDR1的表达 在TargetScan数据库中分析发现，miR-486-3p与DDR1存在结合位点；转染后，miR-486-3p与DDR1-3′-UTR-WT存在结合点，而与DDR1-3′-UTR-MUT不存在结合点，见图3。双荧光素酶实验结果显示，与DDR1-3′UTR-WT+对照1组相比，DDR1-3′UTR-WT+miR-486-3p mimic组的荧光素酶活性下降(P<0.05)，而DDR1-3′UTR-MUT+miR-486-3p mimic组的荧光素酶活性差异无统计学意义(P>0.05)，见表3。实时荧光定量PCR结果显示，与对照1组相比，miR-486-3p mimic组OEC-M1细胞的DDR1 mRNA表达水平降低，miR-486-3p inhibitor组OEC-M1细胞的DDR1 mRNA表达水平升高(P<0.05)，见表4。

起初，专家们认为阿尔茨海默病源于基因异常。美国科技畅销书《基因战争》就是从该病入手探讨人类基因组计划的。科学研究亦证实，发生在人体第21条染色体上的变异，可导致阿尔茨海默病，该原因引发的病症有50%的概率遗传到下一代，这种由遗传因素导致的病症，其发病年龄也通常较早。然而进一步的研究表明，基因异常导致的发病只是极少数情况，大部分阿尔茨海默病并不遗传，其原因通常较为复杂：饮食习惯、职业与经济状况、甚至头部遭受重击都可以导致发病。全球65岁以上的老人中，平均每20个人中就有一个患有阿尔茨海默病，由于发病率高，一个家庭中有不止一个病人的情况也较为普遍，因此会造成遗传的错觉。

图3 miR-486-3p与DDR1存在结合位点

表3 各组OEC-M1细胞荧光素酶活性检测结果(x±s)

表4 miR-486-3p对OEC-M1细胞DDR1 mRNA表达水平的影响(x±s)

2.5 槟榔碱对OKF4/TERT-1细胞miR-486-3p和DDR1表达水平的影响 与无槟榔碱组相比，槟榔碱组OKF4/TERT-1细胞中miR-486-3p表达水平降低，DDR1 mRNA和蛋白表达水平升高(P<0.05)。见表5、图4。

表5 两组OKF4/TERT-1细胞miR-486-3p、DDR1 mRNA和蛋白相对表达水平的比较(x±s)

图4 两组OKF4/TERT-1细胞中DDR1蛋白的表达情况

3 讨 论

miRNA参与人类多种疾病，可通过与靶基因的3′UTR结合，在转录后水平上调控靶基因的表达[16]。miR-486-3p作为肿瘤抑制因子，通过抑制多种致癌基因的表达在肿瘤细胞的增殖和转移中发挥关键作用。既往研究结果显示，miR-486-3p在甲状腺乳头状癌[17]、视网膜母细胞瘤[8]、宫颈癌[18]、膀胱[19]中异常表达。但是，有关miR-486-3p对OSCC的影响及其机制目前尚未完全清楚。本研究结果显示，与癌旁组织相比，OSCC组织中miR-486-3p表达水平降低(P<0.05)，说明miR-486-3p可能参与OSCC的发病过程。此外，与对照1组相比，miR-486-3p mimic组OEC-M1细胞增殖能力降低，cleaved Caspase-3表达水平升高，而miR-486-3p inhibitor组OEC-M1细胞增殖能力增高，cleaved Caspase-3表达水平降低(均P<0.05)。Caspase是一类与凋亡密切相关的蛋白水解酶家族,以Caspase前体酶原的形式存在于大多数动物的细胞中。Caspase-3被切割活化后变成cleaved Caspase-3，但cleaved Caspase-3仅存在于正在发生凋亡的细胞中，未凋亡或已经坏死的细胞中检测不出cleaved Caspase-3。因此，该结果说明miR-486-3p可以抑制OSCC细胞增殖，促进OSCC细胞凋亡，从而发挥抑制肿瘤的作用。

羊多杀性巴氏杆菌感染引起的巴氏杆菌病应该结合药敏试验，选择高敏抗生素进行治疗，选择使用硫酸卡那霉素注射液、地塞米松磷酸钠注射液，使用剂量分别为1.5万IU/kg体重、4 mg/只羊，混合后肌肉注射，1次/d，连续使用3 d[2]。同时在饮用水中添加0.1%的氟哌酸，让患病羊自由饮水。对于体温升高、不能正常进食、病情较为严重的患病羊，选择使用30%的安乃近注射液5 mL、5%的糖盐水500 mL、维生素C5 mL，混合后静脉注射，1次/d，连续使用3 d，强化补液[3]。

DDR1在多种肿瘤患者体内呈高表达，并作为肿瘤蛋白在肿瘤细胞的生存、增殖、耐药、侵袭性和迁移等过程中发挥作用[20]。高水平的DDR1可通过激活Notch受体1和Ras/Raf/丝裂原活化蛋白激酶信号通路提高肿瘤细胞的生存能力[21]。本研究结果显示，与对照2组相比，sh-DDR1组OEC-M1细胞增殖能力降低，cleaved Caspase-3表达水平升高，而OE-DDR1组OEC-M1细胞增殖能力升高，cleaved Caspase-3表达水平降低(均P<0.05)，说明抑制DDR1表达可以抑制OSCC细胞增殖，促进OSCC细胞凋亡。这提示DDR1在OSCC细胞生存中发挥了重要的作用，这为未来研究DDR1对OSCC细胞生存的影响及相关机制提供了框架。

本研究结果还显示，与对照1组相比，miR-486-3p mimic组OEC-M1细胞的DDR1 mRNA表达水平降低，miR-486-3p inhibitor组OEC-M1细胞的DDR1 mRNA表达水平升高(均P<0.05)；此外，双荧光素酶实验结果和生物信息学分析显示，miR-486-3p与DDR1存在结合位点，说明miR-486-3p可以直接通过与DDR1 3′UTR结合来下调DDR1的表达，从而发挥抑癌作用。

咀嚼槟榔是导致口腔黏膜纤维化的最主要原因，可增加口腔癌发病率，还与口腔白斑和口腔扁平苔藓等癌前病变密切相关[22]。有研究显示，槟榔是台湾地区人群患口腔癌最常见的环境危险因素[23]。咀嚼槟榔致口腔癌的原因可能是因为槟榔的多种活性成分和代谢产物(包括槟榔生物碱、槟榔鞣质、槟榔特异性亚硝胺和活性氧等)具有细胞毒性、遗传毒性，甚至直接致癌性[24]。本研究结果显示，与无槟榔碱组相比，槟榔碱组OKF4/TERT-1细胞中的miR-486-3p表达水平降低，DDR1 mRNA和蛋白表达水平升高(均P<0.05)，说明槟榔可能通过调控miR-486-3p和DDR1的表达从而引起口腔癌的发病。

综上所述，OSCC组织中miR-486-3p表达水平降低，miR-486-3p可能通过靶向下调DDR1的表达，抑制OSCC细胞增殖，促进OSCC细胞凋亡，进而发挥抑癌作用。槟榔碱可下调正常口腔角质形成细胞中miR-486-3p的表达，而上调DDR1的表达，槟榔可能通过调控miR-486-3p和DDR1的表达从而诱发口腔癌。本研究结果或许可为临床上治疗咀嚼槟榔所致的OSCC提供了新的思路。