水凝胶材料在骨骼肌组织再生的研究进展

宁晓桥 刘 湘 晋 茹 叶 国

1.口腔疾病与生物医学重庆市重点实验室 重庆市高校市级口腔生物医学工程重点实验室，重庆 400000；2.重庆医科大学附属口腔医院附三院门诊部，重庆 400000

骨骼肌在人体内数量丰富， 约占成年人体重的40%[1]。 轻微损伤的骨骼肌具有极高的再生能力，但由于战伤、车祸伤等导致骨骼肌大体积缺失（volumetric muscle loss，VML）[2]，包括卫星细胞、血管周围干细胞等再生必需成分丢失，内源性自我修复能力就会严重受损。 肌肉再生不足会出现过度纤维化和瘢痕形成，导致肌肉功能障碍甚至功能丧失，极大影响患者的生活质量[3]。

目前临床可采用自体健康的骨骼肌组织替代受损或缺失的肌肉，而自体组织移植成本高昂且伴随较大风险，手术成功后也不能保证完全恢复功能[4]。 因此，在生物医学领域，骨骼肌组织的修复与再生备受关注。 近年来，已经尝试将脱细胞生物支架、生长因子、干细胞及其他天然和人工合成材料用于骨骼肌的再生和功能恢复[5]。 但在肌肉组织结构完整性严重受损的情况下， 单纯的细胞输送存在植入细胞存活不良、植入位点细胞滞留时间短等问题[6-7]，而直接注射细胞因子也不可行，将细胞、细胞因子与生物支架材料结合将会更适用于骨骼肌的再生。

在众多支架材料中，水凝胶作为一种以水为分散介质的高分子网络体系，具有性质柔软、能吸收大量水分并保持一定形状的特点[8]。它能均匀封装细胞，并模拟天然组织的结构和力学特性， 提供利于细胞存活、增殖、分化和骨骼肌组织再生修复的具有高含水量的独特微环境[9]。 目前利用水凝胶输送细胞和生长因子已成为骨骼肌组织再生的潜在解决方案，本文将对近年来水凝胶材料的分类、制备及其应用于骨骼肌再生修复的最新研究综述如下。

1 水凝胶的来源分类

1.1 天然水凝胶

天然水凝胶的原材料来自天然生物材料，通常为胶原、纤维蛋白、明胶、角蛋白、丝素等蛋白质[10]，以及海藻酸盐、透明质酸、壳聚糖、纤维素等天然聚合物[11]。 天然水凝胶具有良好的生物相容性和生物活性，能促进细胞黏附、增殖和组织修复再生[12]，但也存在不稳定、强度较差、来源有限的问题，较难进行化学修饰，在某些情况下还具有免疫原性[13]。

1.2 合成水凝胶

合成水凝胶可由聚乙二醇、聚丙烯酰胺、聚乳酸、聚乙醇酸等小分子单体或合成高分子制备，具有基本的结构单元，可以根据应用要求调整水凝胶的特性[14]，例如在聚乙二醇和纤维蛋白原组合制备光交联水凝胶的过程中，通过改变聚乙二醇的分子量和比例即可调整水凝胶的弹性模量[15]。 合成水凝胶还具有可靠的原料来源和较长的保质期，种类更加广泛，可以大量生产，稳定性好，但是合成过程中可能会引入化学交联剂等有毒物质成分，降解性和生物相容性欠佳[16]。

2 水凝胶的制备

通常情况下，水凝胶是通过物理或化学这两种最基础的交联方式制成。 物理交联主要包括范德华力、氢键、链缠结等，在较温和的条件下即可形成聚合物网络，例如对聚乙烯醇溶液进行循环冷冻-解冻处理，即可形成水凝胶[17]。 物理交联水凝胶没有加入化学交联剂，避免对组织造成潜在毒性，体内运用较为安全，但交联结构存在稳定性差、力学性能低、快速降解等问题[18]。 化学交联是通过共价键将网络中的聚合物链连接而成，包括自由基聚合、辐射聚合等，化学交联水凝胶聚合物链之间存在不可逆的、 永久性的连接，水凝胶具有稳定的结构和优异的力学性能，且降解性能可调[19]，不过水凝胶内部也可能残留有毒化学物质，如未将水凝胶中残留的交联剂去净，交联剂还可能引起免疫炎症反应[20-21]。

3 水凝胶材料在骨骼肌再生的应用

3.1 天然水凝胶

3.1.1 藻酸盐水凝胶 海藻酸是一类来自褐藻或细菌细胞壁的天然多糖醛酸，来源丰富，生物相容性良好，具有非免疫原性[22]。 海藻酸具有温和的凝胶行为，可以形成水凝胶输送生长因子或其他药物，也可用作组织工程细胞输送的载体和支持基质[23]。 单纯的海藻酸盐材料由于缺乏细胞识别位点， 不利于细胞黏附，需要通过改性来提高材料的细胞黏附能力和生长因子等的运载和释放效果，以满足肌肉组织工程的应用要求。 Ciriza 等[24]采用可注射的藻酸盐基水凝胶运载硼酸钠，通过刺激细胞内信号传导来促进损伤后肌肉的再生。Yi 等[25]使用明胶和肝素改性的藻酸盐水凝胶结合骨骼肌细胞外基质培养骨骼肌祖细胞（skeletal muscle progenitor cells），材料能保持细胞活性，并为人骨骼肌祖细胞的生长和肌肉生成创造合适条件。

3.1.2 角蛋白水凝胶 角蛋白是头发、 指甲的主要成分， 而角蛋白类材料具有生物降解性和生物相容性，可制成海绵、薄膜和水凝胶，在骨组织和神经再生方面表现出积极效果[26]。 在骨骼肌再生方面，改变角蛋白的浓度和蛋白类型能调整水凝胶的弹性模量，制备不同降解速率的角蛋白水凝胶还能够运载生长因子并调节其释放过程[27]。Baker 等[28]在小鼠背阔肌肌肉损伤模型植入载有骨骼肌祖细胞和不同生长因子的角蛋白水凝胶，载有碱性成纤维细胞生长因子和胰岛素生长因子的水凝胶在植入2 个月后表现出更大的肌力恢复效果。 此外，Passipieri 等[29]将单纯的角蛋白水凝胶以及载有生长因子的角蛋白水凝胶植入大鼠胫骨前肌肌肉缺损8 周和12 周后，能改善肌肉功能，形成更多的新生肌肉组织，提示角蛋白水凝胶材料不仅适用于细胞和生长因子的递送，自身也具有一定促进肌肉再生的效果，但是其促进骨骼肌再生的具体机制尚不清楚。

3.1.3 纤维蛋白水凝胶 纤维蛋白是一种可用于细胞输送的天然细胞外基质， 是组织损伤后修复的支架，基于纤维蛋白的生物材料也应用于肌肉组织工程。但是，单纯植入纤维蛋白水凝胶材料后其肌肉再生效果有限，Marcinczyk 等[30]利用纤维蛋白原和层粘连蛋白-111 制备水凝胶， 虽然水凝胶在植入小鼠VML 损伤模型两周后显著改善了肌肉重量，但四周后却没有改善肌肉的重量和力量。将纤维蛋白水凝胶与细胞移植结合可能是实现肌肉组织再生的途径，Kim 等[31]尝试将载细胞的纤维蛋白凝胶以多次注射的方式植入裸鼠皮下，并显示出更高的肌肉组织重建和功能改善能力。Liu 等[32]还制备具有大孔结构的纤维蛋白水凝胶，包裹的人脐带间充质干细胞表现出很高的存活率、增殖能力和肌源性分化能力。

3.1.4 透明质酸水凝胶 透明质酸是由N-乙酰葡糖胺和葡萄糖醛酸组成的双糖单位， 广泛分布于人体皮肤、晶状体、软骨等区域的细胞外基质中，是细胞外基质的主要组成部分[33]，其在细胞信号转导和伤口愈合中起着关键作用[34]。 透明质酸水凝胶在肌肉再生中的应用也表现出一定效果，研究发现，适当浓度的透明质酸水凝胶与骨骼肌成肌细胞具有良好的相容性，水凝胶利于细胞黏附， 并能作为细胞生长的三维支架[35]。 将载有新分离卫星细胞的透明质酸水凝胶植入小鼠胫骨前肌肌肉缺损后，能显著改善肌肉结构和新生肌纤维数量，促进肌肉功能恢复[36]。Goldman 等[37]还将添加层粘连蛋白-111 的透明质酸水凝胶联合碎肌移植来引导VML 缺损处的肌肉再生， 也恢复了肌肉的部分功能。

3.1.5 脱细胞外基质水凝胶 脱细胞组织是去除组织或器官内细胞成分而保留细胞外基质（extracellular matrix，ECM）成分和三维结构的天然支架，具有生物相容性和生物活性[38]。ECM 水凝胶具有可注射性和填充不规则缺损的能力，在骨骼肌再生方面具有巨大潜力。 目前细胞外基质水凝胶种类多样，通过选择合适的水凝胶并与细胞移植相结合，可能是一种更有效的骨骼肌再生方案。而不同来源的脱细胞外基质也拥有不同的肌肉再生效果，利用脱细胞骨骼肌生产的可注射水凝胶能在体外诱导血管细胞和成肌细胞增殖[39]，猪真皮ECM 水凝胶利于C2C12 成肌细胞融合，而猪膀胱ECM 水凝胶在体内降解更快且促肌肉再生效果更好[40]。 脱细胞外基质水凝胶还可运载细胞，Rao 等[41]利用脱细胞骨骼肌制备纳米纤维细胞外基质水凝胶，通过在水凝胶内加入骨骼肌成纤维细胞，创造出一种能增强成肌细胞代谢活性和分化能力的特殊微环境，可提高可注射ECM 水凝胶运载细胞的存活率， 缓解注射压力和缺血环境对细胞的伤害。

3.1.6 壳聚糖衍生物水凝胶 壳聚糖作为一种天然多糖，具有生物相容性，能够在体内完全降解，但在水中的溶解度有限。 N-羧乙基壳聚糖（N-carboxyethyl chitosan，CECS）在水中具有足够的溶解性，是用于细胞输送的极佳候选材料[42]。 近年来，具有优良导电性和水凝胶特性的导电水凝胶在组织再生方面显示出巨大潜力[43]，而肌肉细胞固有的电兴奋性也启发研究人员将电活性支架应用于骨骼肌再生。 Guo 等[44]利用N-羧乙基壳聚糖和葡聚糖接枝苯胺四聚体接枝4-甲酰苯甲酸（dextran-graft-aniline tetramer-graft-4-formyl benzoic acid）合成一系列可注射自愈性导电水凝胶，水凝胶表现出足够的电活性和导电性，C2C12 细胞能从水凝胶基质中释放并表现出持续增殖能力，并且水凝胶还能在体内促进骨骼肌的再生。表明壳聚糖来源的可注射自愈合导电水凝胶拥有成为细胞递送载体治疗骨骼肌损伤的潜力，而赋予水凝胶导电性也许是改善材料肌肉再生能力的潜在方向。

3.2 合成水凝胶

合成水凝胶在骨骼肌再生研究中也有少量报道，也可作为细胞递送的载体应用于骨骼肌再生，但受合成材料生物相容性和生物活性的限制，若仅使用合成水凝胶修复骨骼肌缺损，效果可能不太理想，若能对其改性， 有望克服单一材料的缺陷， 改善材料性能。Han 等[45]利用聚乙二醇合成一种黏接性水凝胶，利用水凝胶将具有促肌肉生长修复的WNT7a 和原代肌卫星细胞输送到冷冻损伤的胫骨前肌，显著促进了卫星细胞的增殖迁移和肌纤维的肥大。Ziemkiewicz 等[46]制备层粘连蛋白-111 功能化的聚乙二醇并将其混入聚乙二醇二丙烯酸酯（PEG-diacrylate，PEGDA）水凝胶中，水凝胶也利于成肌细胞存活、黏附。

3.3 杂化水凝胶

为进一步优化水凝胶的各种特性，模仿细胞外基质，改善细胞黏附和组织反应，将天然和合成聚合物结合可制备杂化水凝胶（hybrid hydrogel），杂化水凝胶可同时拥有天然及合成材料的优势，在骨骼肌再生方面具有较大潜力。Carleton 等[47]制备了甲基丙烯酸-聚乙二醇水凝胶和甲基丙烯酸-胶原水凝胶， 并探究两种材料在VML 损伤中的再生效应， 将水凝胶植入CD1 小鼠胫骨前肌VML 损伤模型后， 发现甲基丙烯酸-胶原水凝胶能够恢复肌肉质量和功能， 同时提高血管化和神经支配。另外，Raj 等[48]将胆囊细胞外基质与聚乙二醇二丙烯酸酯结合，制备出具有更高机械强度的生物合成水凝胶并希望用于高张力部位的肌肉再生，但该研究仅停留在材料和细胞学层面，缺乏动物实验验证。

4 小结与展望

VML 会严重损害机体的自我修复能力， 而临床常规治疗手段难以实现肌肉功能完全恢复的同时还存在一定局限性。 伴随着骨骼肌再生相关研究的进行， 水凝胶材料在骨骼肌组织再生方面取得诸多进展。目前已经利用多种天然及合成水凝胶材料结合细胞、生长因子等应用于骨骼肌组织的再生修复，表现出增加肌纤维再生、提高血管化、改善肌力等效果，但这些研究都有一定的局限性，目前仍然没有合适材料实现骨骼肌缺损的完全修复。为提高水凝胶材料运载细胞的存活、增殖、分化能力，实现各种生长因子合理有效释放，以及动员机体发挥自身的修复能力，仍需要探索更加合适有效的材料和治疗方案。