羊毛角蛋白的提取及其在大健康领域的应用进展

戚欣然，郑兆柱

（苏州大学 纺织与服装工程学院，江苏 苏州 215123）

1 角蛋白简介及羊毛角蛋白结构

角蛋白是一种蛋白质，属于纤维蛋白，也是非营养性的蛋白质，广泛存在于人和动物的表皮中，是毛发、羽毛、蹄、角等的主要成分，也是结缔组织重要的结构蛋白质。角蛋白在一级结构上分为主链和侧链，侧链的种类和性质决定了角蛋白整体的物理和化学性质。

角蛋白是羊毛纤维的主要成分，羊毛角蛋白由18种氨基酸残基构成，在自然状态下有两种结构，分别为α-螺旋和β-折叠，α-螺旋结构是自然状态的主要形态。α-螺旋结构按照角蛋白的纵轴方向平行有序地排列，填充在羊毛纤维中间的是中间丝蛋白。角蛋白虽然种类不同，但都具有类似的分子结构，分为螺旋杆状区、非螺旋的头区和尾区以及连接区。

2 羊毛角蛋白的制备、纯化方法及优缺点比较

2.1 机械法

利用外力或高压作用对纤维结构造成破坏，达到降解目的。纤维受外力作用，在高温下二硫键破裂，使纤维中的角蛋白溶解，得到相对分子质量不等的混合可溶性角蛋白溶液。

高压水解法需使用高压锅，在0.6 MPa和165～170 ℃的状态下保持1.0 h，在此过程中，角蛋白一级结构中的侧链基团遭到破坏，而后通过过滤除杂和冻干制得角蛋白。这种方法环境条件苛刻、工艺较难控制，还会破坏角蛋白内的氨基酸。膨化法和挤压法在纺织工业中不常用。

2.2 酸碱法

酸碱法包括酸性法与碱性法。酸性法使用盐酸等强无机酸与原料反应，同时加入巯基乙酸等，在低温下长时间反应。碱性法主要利用NaOH和Na2S等强碱性物质的溶液来溶解纤维原料。两种方法旨在破坏二硫键并使肽键发生断裂。

此外，酸碱法会产生大量酸碱性废水或废酸蒸汽等，造成污染。

2.3 氧化还原法

2.3.1 还原法

还原法均利用尿素破坏蛋白分子间的作用力，降低分子的交联程度，以实现提取角蛋白的目的。此法需要封闭巯基，防止产生的半胱氨酸残基被氧化。通过这种原理制得的角蛋白溶液往往稳定性较差，可以利用表面活性剂与角蛋白产生的胶束来抑制氧化现象和沉淀现象，常用的表面活性剂是SDS。放入60 ℃烘箱2.0 h，得到大部分溶解的羊毛角蛋白悬浊液，再置于透析袋中进行透析，最终获得羊毛角蛋白溶液。通过该原理制取溶液操作简单，是实验室制备羊毛角蛋白的常用方法。

2.3.2 氧化法

氧化剂会破坏羊毛中的二硫键，形成新的亲水性基团，再经烘干得到所需要的角蛋白。研磨后，利用强酸溶液制得羊毛角蛋白溶液。

2.4 生物法

采用生物酶或特定微生物的蛋白酶降解羊毛[1]，提取后利用高温酶失活，过滤底部杂质，获得上层可溶性羊毛角蛋白清液。该方法对角蛋白和氨基酸的破坏力较小，但所需时间较长且实验耗材较贵，不常用。

2.5 微波法

用尿素等混合液对羊毛进行预处理[2]。混合物的消解罐于微波仪中升温，恒温保持2.0 h，微波功率为400 W。将反应后的羊毛角蛋白溶液用丝光棉滤布过滤，经二次离心及透析，冷冻提纯得到羊毛角蛋白。该方法在较低温度下得到了较好的羊毛角蛋白溶解率，既保证了角蛋白的活性，又绿色环保。

2.6 离子液体法

含有阴阳离子的液体在高温下破坏羊毛原纤的分子作用力[3]，且在回收过程中离子不溶于水，沉淀在溶液底部，所以直接用过滤法回收即可，绿色环保，但该方法提取率低。

2.7 金属盐法

利用金属盐对氢键的破坏作用，可以添加还原剂与试剂混合使用，提取出浓度较高的角蛋白溶液[4]。该方法溶解率低、反应进程难以很好地控制。

2.8 铜氨溶液法

利用铜氨、铜乙二胺对氢键的破坏作用，可以添加还原剂与铜氨溶液混合，可较好地溶解羊毛角蛋白且浓度较高[5]。

2.9 电化学氧化还原法

通过电化学氧化还原反应加速实验进程，防止巯基被氧化[6]。该方法过程复杂烦琐，电极槽中的产物复杂、难以提纯。

2.10 熔融尿素法

升温加入尿素至熔融状态，尿素与羊毛的比例为10∶1，在冷却过程中加入10份额的尿素以防止尿素迅速凝固。再经后滤、透析、冷冻得到纯角蛋白粉末。该方法较为简单易行。

3 羊毛角蛋白的应用形式

3.1 凝胶

在提取的羊毛角蛋白溶液冻干后，将其研磨成粉末。称取适量角蛋白粉末与蒸馏水混合，再加入L-半胱氨酸，搅拌至溶解后，置于集热式恒温加热磁力搅拌器中，加入转子搅拌，在65 ℃条件下反应30 min后取出，置于室温下冷却，形成羊毛角蛋白水凝胶。也可选用卧式静电纺丝方式进行纺丝[7]，再将静电纺纤维膜置于光交联液中，于紫外线下照射30 min完成交联，反复浸泡冲磷酸盐缓冲液洗去多余的光交联液，得到羊毛角蛋白纳米纤维水凝胶。

3.2 膜

将增塑剂丙二醇、二甘醇加入角蛋白溶液，升温至60 ℃，保证增塑剂充分溶解，使制成的膜具有均一性。膜具有高模高强、伸长度好、弯曲刚裂度低的特点，同时通过细胞培养、皮肤刺激等实验证明了该膜的良好生物相容性[8]。有团队运用热压阀将角蛋白溶液与改性剂甘油混合，经透气量仪和抗静电测试，研究角蛋白膜的透气、力学等性能。还可以用交联剂戊二醛对角蛋白膜进行处理，测试结果显示，膜交联程度与强度呈正相关、与伸长率呈负相关[9]。Saika等[10]通过实验改善了角蛋白膜的机械性能和疏水性，并且保留了良好的生物相容性，他们将加入交联剂丙三醇缩水甘油醚的角蛋白溶液与壳聚糖混合。

另外，角蛋白与其他材料结合也可以制得具有多种优点的生物相容性膜。如角蛋白/PVA混合膜[11]，将羊毛角蛋白溶液与质量分数为2%的PVA溶液混合（w/w），在磁力搅拌器上以中速搅拌0.5 h，使两者混合均匀，然后将混合溶液沉降，取出一定量的混合溶液倒入聚乙烯板盒内，自然干燥成膜，即得角蛋白/PVA混合膜。

3.3 支架

丝素蛋白/羊毛角蛋白复合多孔支架[12]：在室温条件下，将质量分数为6%的丝素蛋白溶液和羊毛角蛋白溶液按蛋白比例（丝素蛋白∶羊毛角蛋白）10∶0、8∶2和6∶4进行混合。随着羊毛角蛋白比例的增大，支架难以成型，加入一定质量的甘油（蛋白质量的30%），增强复合支架的韧性。搅拌15～20 min后将混合溶液用移液枪移入24孔板中，接着放入-80 ℃的超低温冰箱中冷冻12.0 h，最后取出并放入冷冻干燥机冷冻干燥48.0 h，得到丝素蛋白羊毛角蛋白复合多孔支架。

4 应用

4.1 生物医学应用

羊毛角蛋白基材料具有很好的机械耐久性和生物相容性，易于生物降解。这些独特的性质在现代生物材料领域引发了一场革命。角蛋白基水凝胶作为生物材料在各种生物医学应用中显示出良好的效果。角蛋白水凝胶（9%）显示出阻止烧伤加重和促进皮肤再生的能力。15%角蛋白水凝胶已被证明对神经再生和恢复有效[13]。5%角蛋白水凝胶和5%聚乙烯醇的混合物有利于伤口愈合[14]。角蛋白聚合物已被用于开发牙组织工程支架：质量分数为20%的角蛋白和3%的甘油水凝胶增强了成牙本质细胞的行为，并在牙髓-牙本质再生中显示出良好的效果[13]。交联的二硫化物水凝胶是药物释放和输送的理想选择。角蛋白烯丙基硫醚水凝胶具有可控降解性，是一种用于包裹和递送细胞的可行基质[14]。

角蛋白膜可用于生产新的可生物降解和生物相容材料，也可用于伤口修复和组织工程，能促进细胞黏附，是一种新的伤口处理方法。用10%的角蛋白和明胶在1.00 mL乙二醇和0.35 mL戊二醛中制成的薄膜显示出显著的机械和吸水性能，因此被用于制作伤口敷料[15]。这些聚合物纳米纤维能恢复天然细胞外基质的功能，在组织工程、药物输送和伤口愈合中发挥了重要作用。角蛋白纤维由聚己内酯与角蛋白以7∶3的比例静电纺丝制成，用于骨组织工程。静电纺丝因具有可靠性和有效性而被用于制备这种纳米纤维。用15%（w/w）甲酸制备的角蛋白-聚酰胺6复合材料被广泛用于生物医疗设备，也可作为净化水的吸附剂[16]。聚乳酸/壳聚糖-角蛋白复合物可促进成骨细胞的刺激和增殖，且有助于骨组织再生[15]。

4.2 美容应用

羊毛角蛋白水解产物可用于各种化妆品中，如针对头发和皮肤的产品。角蛋白肽有助于头发补充水分，提高发丝的光泽度和柔软度；对皮肤有补水作用，可用于制作皮肤保湿剂[13]。羊毛角蛋白能改善头发的机械和热性能，并与水相容，支持其化妆品的使用。羊毛角蛋白水解物作为湿润剂，将水从表皮下层结合到角质层，补充角质层的细胞间脂质，还可以增强皮肤的功能。如溶解的角蛋白结合到天然指甲上，可改善指甲板[13]。

4.3 生物吸附剂

羊毛角蛋白生物材料有助于清除水中的重金属。通过其表面的活性极性位点，以物理和化学的表面机制吸引带电的金属离子。从羊毛中提取的角蛋白分别用于吸附金属铅。

4.4 生物肥料

由于碳和氮的存在，角质废物被用作有机肥料。角蛋白是制备肥料的可靠氮源。羊毛纤维因为富含肽、氨基酸和矿物质而成为生物肥料的良好来源，可帮助修复被污染的土壤，加速植物生长，还有助于作物栽培。