细胞胀亡的研究进展

李祥孟，曾繁浩，倪茂，唐振华，颜汝平

(昆明医科大学第二附属医院，云南 昆明 650000)

1 细胞胀亡的来源和形态学特征

“胀 亡”(oncosis) 来 源 于 希 腊 文“ onkos”, 其表示的意思为肿胀(swelling)。在1910 年，vonReckling-hausen 首次描述在缺血死亡之前的骨细胞出现水分增多而肿胀的现象，后Majno G等[1]将这种细胞死亡称之为细胞胀亡，并认为细胞胀亡不同于细胞凋亡，凋亡和胀亡仅是细胞死亡的两种方式。光镜下可见胀亡细胞的形态学表现主要为细胞体积逐渐增大、内质网、细胞核出现肿胀，核膜、核仁周围出现染色质分离凝集现象，最后常表现为核溶解现象；胞膜逐渐起泡，而液体是膜泡中的主要成分，随着细胞膜通透性增加，细胞膜出现崩解，随即胞内容物出现外溢，细胞呈现自溶样的改变，同时周围常伴有明显的炎症反应，这个过程类似于细胞水样变性、气球样变等一系列形态学的改变[2]。

2 细胞胀亡的分子机制

细胞胀亡的分子机制在龚小红[2]有关细胞胀亡的文章中提到的有“与细胞膜损伤有关的分子机制、与caspase 有关的分子机制、与死亡受体有关的分子机制、与线粒体有关的分子机制、与Bcl-2 家族有关的机制”等五个机制，其中与线粒体相关的机制可进一步细分为线粒体功能失调导致的ATP含量降低和ATP 耗竭相关机制[3]。此以外，水通道蛋白相关分子机子也可诱导细胞胀亡，在Tsai[4]的实验中，通过水通道蛋白激动剂促使大量的水进入癌细胞内，使癌细胞发生不可逆性的肿胀，进而使细胞发生胀亡。

3 细胞胀亡的检测方法

为了更好的研究细胞胀亡在肿瘤治疗中的作用机制，科学有效的检测是相关研究的基础。经过近些年的快速发展，相关的检测方法也越来越全面且精确。(1)用光镜、时差显微镜观察检测，还可以用电镜[5]、采用细胞核染料染色的荧光显微镜[6]以及与其相结合的多通道全息显微镜观察法来观察细胞的细胞核、细胞器、细胞膜等结构的细胞形态学变化来检测。光镜观察顾名思义就是利用光学显微镜观察胀亡细胞的形态学变化，若发生细胞胀亡则出现细胞肿胀、细胞质空泡化改变等现象；时差显微镜相对于光镜的优点在于不需要移动细胞，显微镜观察与细胞培养都在同一个视野内，可以对所有细胞在形态学和组织学上的变化进行观察，这样就更加容易对细胞进行研究；电镜可观察到光镜、时差显微镜观察不到的超微细胞结构，比如细胞膜、细胞核、线粒体、内质网等细胞器以及各个细胞器在形态学和组织学上的变化情况，它是判定细胞胀亡非常重要的一种手段。由于自身观察的局限性，电镜还需在观察的同时联合其他的检测手段进行相互检测；荧光显微镜观察是将细胞核进行染料标记，从观察细胞核形态，而多通道全息显微镜观察则是在荧光的基础上同全息显微镜相结合，以便更容易的转换进行成像。(2)细胞发生凋亡的后期细胞膜的完整性则被破坏，而细胞胀亡启动了细胞胀亡的开关[7]致细胞膜通透性增加的同时细胞膜完整性则就已被破坏，细胞膜的损伤可能来自于膜表面Na+-K+泵以及Ca2+泵功能的障碍和膜受体的改变。其机制主要是缺血性的损害可导致细胞 Na+-K+-ATP 酶活性降低,Na+经过氧化应激激活非选择性阴离子通道从而进入细胞引起细胞胀亡[8]，通过获得细胞悬液之后, 观察细胞膜的通透性是否缺陷可判断细胞是否胀亡。因此碘化丙啶作细胞核染料染色的碘化丙啶吸收试验法、细胞内容物泄漏试验[9]、7-ADD 染色法[10]等。这些染料通过不完整的细胞膜,与胞质内物质进行结合, 细胞膜的完整性可通过荧光强度检测即可得出；乳酸脱氢酶释放试验[11]则是细胞内乳酸脱氢酶通过有功能不足的细胞膜释放到细胞外，释放量一般同细胞膜受损程度相关，所以可以通过检测乳酸脱氢酶释放量来反映细胞膜受损程度，从而有助于对细胞胀亡的判定[11]。(3)线粒体膜电位检测[9]，由于线粒体内膜两侧质子或其他离子分布不均而导致膜电位的形成，有研究报道细胞胀亡与细胞线粒体膜电位的下降有关[12]；但是细胞线粒体膜电位下降的现象也存在于其他细胞死亡方式之中，故对于细胞胀亡而言，通过检测细胞线粒体膜电位来判断细胞胀亡不具有特异性，还需其他有效地方法进行辅助检测。(4)细胞三磷酸腺苷水平检测[13]，细胞胀亡不需要三磷酸腺苷的介导，而细胞凋亡则是需要消耗三磷酸腺苷，因此细胞内三磷酸腺苷含量的检测对于鉴别细胞胀亡或者细胞凋亡具有非常重要的作用。但是针对特异性来说，细胞内三磷酸腺苷含量的检测对于细胞胀亡而言也无特别强的特异性，还需要其他的方法进行辅助检测。(5)细胞ROS 水平检测[14]，有文献报道ROS 的过量生成与细胞发生胀亡有关，其原理是由ROS 介导的细胞胀亡[14]；但其特异性不高，同样需要结合其他辅助检查。(6)实时流式细胞术动力学分析法[15]就是用用染料分别标记检测细胞的线粒体和细胞膜电位，通过流式细胞仪进行检测。这种检测可将凋亡细胞与胀亡细胞进行区分。(7)通过Western blot 实验来检测porimin 和calpain 蛋白的表达情况的相关检测方法[16]，porimin 也被称为促胀亡受体。通过对能表达porimin 蛋白的进行检测这一方法，从而判定细胞胀亡具有重要的作用，同时calpain 在细胞胀亡方面起着非常重要的作用，所以一般检测porimin时也同时检测calpain 蛋白。以上方法有的是比较成熟准确的检测方法，而有的方法其特异性则较低，如7-ADD 染色法、光镜观察法、线粒体膜电位检测等。总而言之，细胞胀亡的检测是以细胞的形态学检查为基础进行的过程，其他检测方法都基于形态学上展开，作为辅助检查手段。

4 肿瘤性疾病是威胁人类长寿的主要障碍之一

4.1 随着社会经济的发展、人口老龄化越发严重和人口的迅速增长，伴随而来的是全世界的肿瘤发病率和肿瘤死亡率也迅速增长。据2018 年全球癌症统计数据表明，非传染性疾病(NCD)现在是造成全球大多数死亡的原因，而肿瘤也将成为21世纪世界各国人民是否长寿的主要原因和面对的挑战性问题。依据世界卫生组织2015 年的预估，在172 个国家中肿瘤将是其中91 个国家70 岁以前死亡的第一或第二大原因，而在其他22 个国家中因肿瘤死亡的原因排名第三或者第四[17]。对此，积极探索癌症的治疗方法将有助于提高人类的生活质量以及为人类的长寿再助力助跑。

4.2 以细胞胀亡的方式诱导肿瘤细胞死亡

在肿瘤的治疗中也有许多通过使肿瘤细胞以细胞胀亡的死亡方式来达到肿瘤的治疗作用[4]。也EnAd(Enadenotucirev) 是从一个腺病毒血清型库中通过生物选择分离出的一种嵌合体B 组腺病毒，被证明能够诱导肺腺癌细胞、卵巢癌细胞等癌细胞通过以细胞胀亡的方式裂解死亡，起到癌治疗的作用效果[18]。除此以外，细胞胀亡也参与了诸如肺、肾、肝[19]等癌细胞以及多种耐药癌细胞[20]、乳腺癌[21,22]、胃癌[23]、脑胶质瘤[24]、选择性杀伤胚胎干细胞预防畸胎瘤的发生[6]等癌细胞的死亡，进而达到杀伤癌细胞，为癌症的治疗尤其是耐药癌的治疗提供了一种有效的治疗方法。其作用机制主要为线粒体功能失调导致的ATP 含量降低和ATP 耗竭以及在水通道蛋白激动剂作用下促使大量的水进入癌细胞内，使癌细胞发生不可逆性的肿胀，进而使细胞发生胀亡。

5 总结与展望

随着对细胞胀亡的不断深入研究，越来越多的研究表明，对目前可用的治疗方法有抵抗力的癌细胞，诱导其以胀亡的方式死亡是一种有效的治疗方法。在众多研究中，“病毒疗法”诱导癌细胞以胀亡的方式死亡就是一种非常具有潜力和优势的方法。利用腺病毒(如EnAd 腺病毒)诱导细胞以肿瘤细胞以细胞胀亡的方式死亡达到治疗肿瘤的效果不仅为肿瘤的治疗提供了一个非传统的治疗方法，而且还为“溶瘤疫苗”概念及研究奠定了机制基础。但目前该方法还仅停留在临床前研究阶段，临床相关性尚未得到验证，有诸多因素限制其在临床试验的应用。如：(1)病毒细胞毒性的确切机制可能因细胞类型而异，导致其产生的治疗效果也有可能因细胞类型而产生差异;(2)EnAd 对人细胞的特异性严重限制了用于免疫原性临床前检测的动物模型。建立动物模型的昂贵花销;(3)细胞生命周期短的腺病毒如何在人体产生抗病毒抗体之前将肿瘤细胞彻底杀死等。另外一个即水通道白激动剂的应用，目前也存在一定的问题需要解决，如AqF026 激动剂可能会促进癌细胞迁移，恶化转移级联反应。因此，需要确定合适的体外剂量或体内浓度；除此以外，AqF026 对癌细胞而非正常细胞的特异性的选择，这表明存在剂量或浓度的上限，从而不影响正常细胞的水通道蛋白等问题需要解决。尽管存在以上问题，但仍不可否认，细胞胀亡参与肿瘤细胞的死亡从而达到治疗的效果将是一个非常有价值和前景的研究。关于胀亡与肿瘤两者关系的研究才开始, 相信随着人类不断深入的研究, 对二者认识也将会更加明白, 相信更多的发现将有助于对肿瘤的预防和治疗。针对组织发育和机体稳态来说，细胞死亡显得十分重要。目前已知焦亡、胀亡、旁凋亡、自噬、凋亡等都属于细胞死亡的方式。其中，细胞凋亡是机体的一种正常代谢性活动，它是由基因调控的细胞主动性死亡的过程，细胞主要以萎缩和核碎裂为主要表现形式。临床上有通过诱导细胞凋亡的方式来发挥抗肿瘤作用的药物，但是肿瘤细胞耐药的出现导致未能达到理想的效果，治疗效果未达到医患的期望。对于细胞死亡方式的研究已经较为成熟、深入和透彻，同时检测方法也比较全面。细胞胀亡不是一种主动性的细胞死亡方式，它是由生物不相容的物理条件或化学条件非特异性毒性引起的死亡。一系列的前期发展研究表面，细胞胀亡在细胞死亡方式中占有重要的地位，青蒿酯、黄连素、茄边碱等化合物可诱导细胞胀亡的发生。细胞胀亡和细胞凋亡是两个不同的概念，因此对于存在凋亡通路缺陷或者凋亡耐药的肿瘤来说，诱导细胞胀亡是克服肿瘤细胞对化疗药物的耐药的有效方法，进而发挥抗肿瘤的作用，除此以外，细胞凋亡的细胞死亡方式也有助于解决凋亡耐药的问题、有利于抗肿瘤新靶点的探索以及抗肿瘤新方法的制定。另外，细胞胀亡同样存在于心血管疾病、消化系统疾病、神经系统性疾病等的发生发展过程，对以上系统等的预防以及治疗具有潜在的重大意义，对此也猜测，细胞凋亡也可能参与泌尿生殖系统疾病的发生发展、对细胞凋亡的深入研究，将有助于提高各系统肿瘤疾病的治疗效果，改善患者的生活质量。