miR-299-3p靶向OCT4B1调控结直肠癌细胞SW480增殖、迁移、侵袭及凋亡

符国宏， 赵宇青， 郑杨慈， 吴开李， 李立新， 王连臣

(三亚中心医院 海南省第三人民医院普外科，海南省三亚市572000)

结直肠癌(colorectal cancer，CRC)是全球最常见的恶性肿瘤，其高死亡率与肿瘤转移相关，转移性CRC患者5年生存率仅10%～15%[1]。miRNAs是单链、内源性非编码RNA，可靶向靶基因3′-非翻译区(3′-UTR)来调节基因表达[2]。有研究表明，miRNAs通过调节多种信号通路参与肿瘤发生和发展[3-4]。miR-708、miR-150抑制CRC细胞增殖、转移并诱导细胞凋亡[5]。miR-299-3p对细胞增殖和迁移的抑制作用也在视网膜母细胞瘤、胃癌和前列腺癌中得到证实[6-7]。干细胞基因如OCT4B1在致癌和肿瘤行为中发挥重要作用，如子宫内膜癌[8]。最近研究表明，miR-299-3p可维持内皮细胞OCT4B1稳态和生理功能，且下调OCT4B1的表达影响胃癌细胞增殖、侵袭和凋亡[9]。但miR-299-3p与OCT4B1在CRC细胞中的功能仍不清楚。本研究拟探讨miR-299-3p靶向OCT4B1调控CRC细胞SW480增殖、迁移、侵袭及凋亡的作用，为CRC治疗靶点的研究提供参考。

1 材料和方法

1.1 试剂及仪器

RPMI-1640培养基(美国HyClone)；HiPerFect Transfection Reagent(德国大通基因生物科技)；细胞计数试剂盒-8(CCK-8)(美国Sigma公司)；AnnexinV-FITC、碘化丙啶(美国BioLegend生物科技)；Transwell室(北京优尼康生物科技有限公司)；MatrigelTMBasement Membrane Matrix(北京明阳科华生物科技有限公司)；TRIzol®试剂(美国Invitrogen公司)；TaqMan microRNA反转录试剂盒(美国通用应用生物科技)；AB ScriptII cDNA第一链合成试剂盒(中国碧云天生物科技)；10%胎牛血清、Taq Man miRNA Assay Probes、SYBR Premix ExTaqTMReal-Time PCR Kit(赛默飞世)；OCT4B1、β-肌动蛋白一抗、辣根过氧化物酶偶联二抗(美国细胞信号技术公司)。

1.2 细胞培养及分组

人CRC SW480细胞在RPMI-1640培养基(含10%胎牛血清)37 ℃、5%CO2培养。将SW480细胞分为NC组、mimics组、inhibitor组，分别转染miR-NC(空白载体)、miR-299-3p过表达载体(miR-299-3p mimics)、miR-299-3p低表达载体(miR-299-3p inhibitor)质粒，所有质粒由GeneBio Pharma(中国上海)设计和合成。

1.3 细胞活力及单克隆形成数的测定

将转染的细胞以4×103个/孔接种到96孔板并孵育72 h。将细胞与10 μL CCK-8溶液37 ℃共孵育2 h，使用酶标仪在450 nm测量每个时间点光密度(OD)，并计算细胞存活率。存活率(%)=(实验组OD-空白组OD)/(对照组OD-空白组OD)×100%。

将各组SW480细胞用0.25%胰蛋白酶消化成单细胞，以4×105个/孔接种到6孔培养板，24 h后将50个细胞接种于6孔培养板，继续培养2周，将细胞用结晶紫-福尔马林溶液染色10 min，并计数细胞单克隆形成数。

1.4 流式细胞仪测定细胞凋亡

转染72 h后，收获细胞，PBS洗涤2次，4 ℃ 70%乙醇固定1 h。细胞与50 μL RNase1室温下孵育10 min以降解RNA。将细胞在4 ℃下15 g离心5 min，然后加入5 μL Annexin V-FITC、5 μL碘化丙啶室温下暗处双染色30 min。使用FACScan流式细胞仪测定细胞凋亡。

1.5 Transwell室法测定细胞侵袭

细胞侵袭使用Transwell室在37 ℃、50 μL MatrigelTMBasement Membrane Matrix下预包被2 h进行评估。SW480细胞加入上室，在37 ℃下培养24 h后，迁移到下室的细胞10%甲醇固定30 s，0.1%结晶紫染色后在光学显微镜下计数。

1.6 qRT-PCR测定miR-299-3p、OCT4B1 mRNA表达

使用TRIzol®试剂从细胞系中提取总RNA，并使用Taq Man microRNA反转录试剂盒或ABS criptII cDNA第一链合成试剂盒在37 ℃ 60 min或98 ℃ 10 min合成cDNA。使用Taq Man miRNA Assay Probes或SYBR Premix ExTaqTMReal-Time PCR试剂盒进行qRT-PCR。热循环条件：95 ℃ 3 min，95 ℃ 30 s，40个循环，60 ℃ 1 min。miR-299-3p和OCT4B1表达分别以U6和β-肌动蛋白为内参，并使用2-ΔΔCq方法计算。所有实验重复3次。

引物序列：miR-299-3p正向5′-TCGACUTGCGA TCGATCGAUTCGATCGATCU-3′，反向5′-UTCGATC TAGCUTCGATCGTAUTCGATCGATCA-3′；U6正向5′-TGUTGTGCTAGCTAGCTAGCTAGCAUTGCTAGCT AGU-3′，反向5′-TUGTGCTAGCTAGCTAGCUTUGTGATCGATCGATGC-3′；OCT4B1正向5′-TCGATCGTACGTAGCTAGCTAGCTAGTGCTAGCTAGCTA-3′，反向5′-TGCTAGCTAGTGTCGTAGCUTCGATCGTA GCTAGCTAGC-3′；β-肌动蛋白正向5′-TCGATCGTAGCTAGCTAGCTAGGGTAGCTAGCTAGCTAGCTA GCTGGGTGTC-3′，反向5′-TGTGCTAGCTACGTGG GGTAGCTAGCTAGCTAGCTAGCTAGCTAGGGTC-3′。

1.7 蛋白印记法测定OCT4B1蛋白表达

用RIPA裂解液从细胞中提取总蛋白质样品，使用BCA蛋白质测定试剂盒测定蛋白质水平。将等量蛋白质样品(30 μg)在10% SDS-PAGE上分离并转移到PVDF膜上。用5%脱脂牛奶在含有0.2% Tween-20(TBST)的Tris缓冲盐水中室温封闭膜2 h。然后，将膜与OCT4B1和GAPDH的一抗4 ℃孵育过夜。用TBST洗涤后，将膜与山羊抗兔IgG-辣根过氧化物酶二抗室温下孵育2 h，并通过增强型化学发光检测系统捕获印记信号。

1.8 荧光素酶报告基因实验

miR-299-3p与OCT4B1的结合位点通过网站Targetscan得到(http://www.targetscan.org/vert_72/)。用0.4 μg萤火虫荧光素酶报告载体和0.08 μg海肾荧光素酶pRLTK对照载体，添加或不添加0.5 μg miR-299-3p mimic，共转染细胞。采用双荧光素酶法连续测定萤火虫和海肾荧光素酶活性。

1.9 统计学分析

2 结 果

2.1 miR-299-3p抑制OCT4B1的表达

与NC组比较，miR-299-3p水平mimics组升高，inhibitor组降低，且mimics组高于inhibitor组；OCT4B1 mRNA和蛋白水平mimics组降低，inhibitor组升高，且mimics组低于inhibitor组(P<0.05；表1和图1)。

图1 各组SW480细胞OCT4B1蛋白的比较

表1 各组SW480细胞miR-299-3p、OCT4B1 mRNA和蛋白水平的比较

2.2 miR-299-3p靶向调控OCT4B1

生物信息学预测发现miR-299-3p与OCT4B1序列之间存在结合位点；与NC组比较，miR-299-3p mimic和pGL3-wt 3′-UTR载体共转染细胞荧光素酶活性明显降低(图2)。

图2 OCT4B1靶向调控miR-299-3p

2.3 各组SW480细胞存活率和单克隆形成数的比较

与NC组比较，细胞存活率和单克隆形成数mimics组降低，inhibitor组升高，且mimics组低于inhibitor组(P<0.05；图3)。

图3 各组SW480细胞存活率和单克隆形成数的比较

2.4 各组SW480细胞凋亡率和侵袭能力的比较

与NC组比较，细胞凋亡率mimics组升高，inhibitor组降低，且mimics组高于inhibitor组；细胞穿膜数mimics组降低，inhibitor组升高，且mimics组低于inhibitor组(P<0.05；图4)。

图4 各组SW480细胞凋亡率和侵袭能力的比较

3 讨 论

CRC是全球最常见的恶性胃肠道肿瘤类型，其危险因素包括肥胖、吸烟、遗传因素和慢性肠道炎症，CRC的主要治疗策略已取得进展，但其长期生存率仍然很低，特别是在晚期、局部复发和远处转移的患者。治疗这些患者的一个主要挑战是对CRC发生发展分子机制的认识不足。microRNAs(miRNAs/miRs)由19～25个核苷酸组成，是一组非编码内源性RNA分子，miRNA参与癌细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭，尤其是在CRC中。miR-299-3p，miRNA家族的一员，通过靶向不同的相关分子在各种癌症类型中发挥抑制作用。有研究报道，过表达miR-299-3p直接靶向重组信号结合蛋白Jκ抑制胆囊癌细胞的增殖、迁移和侵袭[12]。在食管鳞状细胞癌中，miR-299-3p靶向I型胶原蛋白α1抑制细胞增殖、侵袭和迁移并促进细胞凋亡[13]。miR-299-3p的低表达与肝细胞癌的临床病理参数相关[14]。本研究结果显示，mimics组存活率、单克隆形成数、穿膜数低于inhibitor组和NC组，而凋亡率高于NC组；inhibitor组存活率、单克隆形成数、穿膜数高于NC组，凋亡率低于NC组；inhibitor组存活率、单克隆形成数、穿膜数高于mimics组，凋亡率低于NC组，表明miR-299-3p可抑制直肠癌细胞SW480增殖、迁移、侵袭，促进其凋亡，miR-299-3p是CRC的肿瘤抑制因子。

据报道，OCT4B1通过促进肿瘤细胞增殖和抑制凋亡进而诱导肿瘤进展。OCT4B1是影响肝癌患者生存的独立因素，其表达与肝癌的发生、发展和预后有关[15]。已证明miR-299-3p可以下调OCT4B1的表达，这可能影响胃癌细胞的增殖、侵袭和凋亡，miR-299-3p和miR-223可以降低OCT4B1 mRNA表达水平，从而影响细胞周期蛋白E的活性和细胞周期进程[16]。在肺癌的体外细胞试验中，抑制miR-157会增加凋亡细胞的数量，这可能是由于内源性OCT4B1通过一种未知机制降低细胞周期蛋白E的活性，最终促进细胞凋亡；此外，促进OCT4B1的表达可导致HCT116细胞活力增加和细胞凋亡抑制，而在转染miR-299-3p后OCT4B1产生了相反的结果[17-18]。这说明HCT116细胞的增殖和凋亡与OCT4B1的作用可能存在直接关系。本研究结果显示，mimics组细胞miR-299-3p高于inhibitor组和NC组，OCT4B1 mRNA和蛋白低于inhibitor组和NC组；inhibitor组细胞miR-299-3p低于inhibitor组和NC组，OCT4B1 mRNA和蛋白高于inhibitor组和NC组；inhibitor组细胞miR-299-3p低于mimics组、OCT4B1 mRNA和蛋白高于mimics组，这提示miR-299-3p能明显抑制OCT4B1 mRNA和蛋白的表达。

综上所述，miR-299-3p过表达可抑制SW480细胞增殖、迁移、侵袭，同时促进其凋亡；其机制可能与miR-299-3p明显抑制OCT4B1 mRNA与蛋白的表达有关。