miR-203a-3p通过ALOX15途径抑制胃癌细胞铁死亡

唐凤英， 董汾， 曾玉婷， 高二鹏， 张锋利， 闫娣

(陕西中医药大学第二附属医院消化内科，陕西省咸阳市712000)

胃癌是中国第二大常见癌症，也是癌症死亡的第二大原因[1]，尽管化疗和靶向治疗胃癌(曲妥珠单抗)获得了部分临床效果，但仍然面临着肿瘤侵袭和转移的问题。铁死亡是一种铁依赖性细胞坏死类型，生理条件下多不饱和脂肪酸经常被脂肪氧化酶氧化，但会立即被谷胱甘肽过氧化物酶4(glutathione peroxidase 4，GPX4)及其辅因子谷胱甘肽还原[2]，然而，当还原功能障碍时脂质过氧化物会在细胞中积累，诱导细胞还原性铁离子被氧化而导致细胞死亡，这称为铁死亡[3]。研究发现，miR-203a-3p和ALOX15参与了胃癌细胞的铁死亡过程，而癌细胞对铁死亡的敏感性与癌症的治疗效果相关[4]，但目前尚无证据表明miR-203a-3p和ALOX15是相互作用从而调控胃癌细胞铁死亡，本文对miR-203a-3p通过ALOX15途径调控胃癌细胞铁死亡的机制进行了研究，现报道如下。

1 材料和方法

1.1 组织取材、主要试剂和仪器

选取2020年1月—2021年1月本院15例胃癌患者术后的胃癌组织和癌旁正常组织，本研究获得本院伦理委员会批准，所有患者均知情同意。线粒体荧光探针(TMRE)购自上海麦克林生化科技有限公司。7-氨基放线霉素D购自YEASEN公司。miRNA模拟物(miRNA mimics)、miRNA抑制剂(miRNA inhibitor)、小干扰RNA(small interfering RNA，siRNA)和过表达质粒均由南京金斯瑞设计和合成。ALOX15抗体购自广州佰汇生物科技有限公司。双荧光素酶报告试剂盒购自诺唯赞公司。酶标仪(318C)购自天美仪拓实验室设备(上海)有限公司。化学发光仪(LAS500)购自Cytiva(思拓凡)公司。实时荧光定量PCR仪购自北京托摩根生物科技有限公司。流式细胞仪(NovoCyte)购自安捷伦科技(中国)有限公司。

1.2 细胞培养和处理

人胃正常细胞GES-1购自深圳震科生物科技有限公司。人胃正常细胞RGM-1购自北京绿源伯德生物科技有限公司。人胃癌细胞株SGC7901、MGC803、MKN45购自PROCELL公司。所有细胞株在DMEM培养基(含10%胎牛血清及1%双抗)37 ℃、5%CO2培养。使用前对每个细胞系进行支原体污染检测。将Lipo3000转染试剂、不同质粒、细胞培养基混合，加入细胞转染12 h后换成正常的培养基。

1.3 免疫印迹法检测ALOX15蛋白水平

从转染的细胞中提取蛋白质，聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质，然后将其转移到聚偏二氟乙烯膜，用5%牛血清蛋白封闭2 h，将膜与一抗4 ℃下孵育过夜。之后，将膜用PBS缓冲液洗涤3次，每次10 min。使用相应HRP标记的二抗将膜在室温下孵育2 h，用PBS缓冲液洗涤3次，通过电化学发光剂检测系统检测ALOX15和GAPDH的蛋白表达水平。

1.4 实时荧光定量PCR检测miR-203a-3p表达水平

使用TRIzol试剂提取细胞mRNA，将mRNA反转录为cDNA。使用SYBR Premix Ex Taq进行实时荧光定量PCR，U6小核RNA(U6 small nuclear RNA，U6)和GAPDH分别为miRNA和mRNA内参。引物序列miR-203a-3p正：5′-CGGCGTGAAATGTTTAGG-3′，反：5′-GTGCAGGGTCCGAGGT-3′；U6正：5′-CTCGCT TCGGCAGCACATAT-3′，反：5′-TTGCGTGTCATCCTTGCG-3；ALOX-15正：5′-ACTGAAATCGGGCTGCAA GGG-3′，反：5′-GGGTGATGGGGGCTGAAATAA-3′；GAPDH正：5′-CCATCACCATCTTCCAGGAGCGA-3′，反：5′-GGATGACCTTGCCCACAGCCTTG-3′。

1.5 RNA高通量测序检测胃癌组织miRNA表达谱

采用TRIzol法提取RNA。NEBNext超定向RNA文库制备试剂盒用于制备链特异性RNA-seq文库。50 ng核糖体去除的RNA样品片段化，使用随机六聚体引物合成第一链和第二链互补DNA(cDNA)。cDNA进行13～15个循环PCR扩增，用Bioanalysisr 2100进行文库分析，然后在HiSeq 2000系统中对cDNA进行测序。

1.6 荧光素酶报告基因分析

合成野生型和突变型ALOX15片段，并将其插入到pMIR-REPORT质粒的荧光素酶报告基因下游(MT-ALOX15 3′UTR和WT-ALOX15 3′UTR)。使用Lipo3000转染试剂将miR-203a-3p mimics与报告基因共转染到SGC7901细胞中。采用双荧光素酶报告试剂盒检测萤火虫和海肾荧光素酶活性。序列miR-203a-3p mimic正：5′-GUGAAAUGUUUAGGACC ACUAG-3′，反：5′-CACUUUACAAAUCCUGGUGAUC-3′；miR-203a-3p inhibitor正5′-CUAGUGGUCCUAAACAUU UCAC-3′，反：5′-GCTCTATTGTGTACTATGA-3′。

1.7 7-氨基放线霉素D法检测lipid-ROS

将细胞接种于6孔板，用含10 μmol/L C24H16Cl2O7无血清培养基培养30 min。收集细胞并用无血清培养基洗涤3次，在无血清培养基中重悬，用5 μL 7-氨基放线霉素D黑暗孵育5 min。采用酶标仪检测荧光强度，激发波长488 nm，发射波长525 nm。lipid-ROS=样品荧光强度-空白孔荧光强度。

1.8 流式细胞仪测定线粒体膜电位

细胞接种于6孔板中，加入终浓度0.5 mmol/L TMRE孵育30 min。用PBS清洗细胞去除多余TMRE。收集并重悬标记的细胞，用流式细胞仪分析Ex/Em=549/575 nm处荧光。线粒体膜电位(mitochondrial membrane potential，MMP)=处理过细胞荧光强度/阴性对照荧光强度。处理过的细胞为过表达miR-203a-3p或对照胃癌细胞样品。阴性对照为仅用铁死亡诱导剂Erastin处理后的细胞样品。

1.9 统计学分析

2 结 果

2.1 胃癌组织或细胞miR-203a-3p与铁死亡具有相关性

miR-203a-3p水平胃癌组织高于癌旁正常组织,胃癌细胞株高于胃正常细胞(P<0.05；图1)。lipid-ROS水平胃癌组织低于癌旁正常组织，胃癌细胞株低于胃正常细胞(P<0.05；图1)。胃癌组织miRNA高通量测序miR-203a-3p水平与lipid-ROS水平呈负相关(r=-6.194，P<0.05)。以上提示，胃癌miR-203a-3p与铁死亡具有相关性。

图1 胃癌组织或细胞miR-203a-3p与铁死亡具有相关性

2.2 miR-203a-3p抑制胃癌细胞铁死亡

过表达miR-203a-3p后，胃正常细胞lipid-ROS水平降低；敲低miR-203a-3p后，胃癌细胞株lipid-ROS水平升高(P<0.05；图2)。铁死亡诱导剂Erastin处理后，过表达miR-203a-3p使胃癌细胞株MMP水平降低(P<0.05；图2)。以上提示，miR-203a-3p抑制胃癌细胞铁死亡。

图2 miR-203a-3p抑制胃癌细胞铁死亡

2.3 miR-203a-3p靶向ALOX15调控胃癌细胞铁死亡

mRNA高通量测序发现有59个基因同时满足以下条件：①过表达miR-203a-3p时降低；②敲低miR-203a-3p时升高。筛选上述基因在铁死亡中的功能，发现敲低ALOX15时胃正常细胞lipid-ROS和MMP降低，过表达ALOX15后胃癌细胞株lipid-ROS水平升高(P<0.05)。胃癌组织ALOX15 mRNA水平低于癌旁正常组织(P<0.05)。过表达miR-203a-3p后，ALOX15 mRNA和蛋白水平降低；敲低miR-203a-3p后，ALOX15 mRNA和蛋白水平升高(P<0.05；图3)。以上提示，miR-203a-3p靶向ALOX15调控胃癌细胞铁死亡。

图3 miR-203a-3p靶向ALOX15调控胃癌细胞铁死亡

2.4 miR-203a-3p和ALOX15结合位点分析

图4显示，miR-203a-3p能特异性与ALOX15结合(图4)。

图4 miR-203a-3p与ALOX15的结合位点

3 讨 论

细胞死亡受到复杂的胞内和胞外信号的严格调控，是包括体内平衡、发育和疾病在内的各种生物过程所必需的[5]。癌细胞增殖与死亡的不平衡是导致恶性生物学特性产生的重要原因[6]。肿瘤细胞已经显示出复杂的代谢适应策略，以在代谢应激条件下生存并允许肿瘤发展，包括阻断细胞程序性死亡[7]。铁死亡是一种新型的细胞程序性死亡，涉及铁依赖的lipid-ROS的积累[8]。最近的研究表明，铁死亡在介导某些类型癌症的肿瘤发展和耐药中有重要作用，但其详细的分子机制尚不清楚，包括胃癌[9]。本研究鉴定了胃癌细胞中铁死亡的关键分子ALOX15和miR-203a-3p，为胃癌药物研发提供了新靶标。

本研究发现，过表达miR-203a-3p后，胃正常细胞lipid-ROS降低、胃癌细胞MMP水平降低。敲低miR-203a-3p后，胃癌细胞株lipid-ROS水平升高。有研究发现，miR-203a-3p可通过调控PI3K/Akt通路促进肝细胞增殖[10]。最近研究发现，miR-203a-3p可通过靶向PDE4D促进结直肠癌的增殖和迁移[11]。但是，这些研究并未将miR-203a-3p与铁死亡进行关联，而是将miR-203a-3p的生物学功能聚焦于细胞凋亡上。本研究发现，miR-203a-3p能够抑制胃癌细胞铁死亡。此外，miR-203a-3p可能是多种肿瘤的促进因子，其在其他肿瘤中的生物学功能是否与铁死亡相关值得进一步探讨。

miRNAs是一类长度为21～25个核苷酸的内源性微小调控RNA，与mRNA的3′-非编码区(UTR)结合，可广泛调控基因表达[12]，这种与特定序列的不完美碱基配对可导致相应mRNA的降解或翻译抑制[13]。已有研究报道，许多miRNAs通过多种途径在调节癌细胞增殖、分化、凋亡、迁移和侵袭等方面发挥重要作用[14]，在胃癌细胞中miR-203a-3p靶向降解了ALOX15 mRNA，减少了ALOX15的蛋白水平，并通过ALOX15调控胃癌细胞的生命进程。在本研究中，过表达miR-203a-3p后，ALOX15 mRNA和蛋白水平降低；敲低miR-203a-3p后，ALOX15 mRNA和蛋白水平升高。同时，miR-203a-3p靶向ALOX15 mRNA发挥作用。

ALOX15是花生四烯酸脂氧合酶家族成员之一[15]。花生四烯酸脂氧合酶家族被认为是脂质过氧化产生的关键介质，并最终导致铁死亡[16]。此外，GPX4对半胱氨酸摄入的抑制和失活都会导致过度的脂质过氧化，从而导致细胞死亡[17]。因此，lipid-ROS在癌细胞中保持动态平衡可避免铁死亡。以前的研究集中在GPX4作为治疗靶点的潜在用途，但如何抑制ALOX15表达的机制仍知之甚少。在本研究中，敲低ALOX15时胃正常细胞lipid-ROS降低和胃癌细胞MMP水平降低。过表达ALOX15后胃癌细胞株lipid-ROS水平升高。此外，胃癌组织ALOX15 mRNA水平低于癌旁正常组织。因此，本研究解释了ALOX15表达减少的原因，为胃癌治疗靶点的选择提供了新思路。

综上所述，ALOX15可以促进胃癌细胞发生铁死亡。胃癌中高表达的miR-203a-3p可靶向ALOX15 mRNA的3′端非编码区，减少ALOX15的蛋白表达水平，抑制了铁死亡的发生。