黄芪免煎颗粒对兔干眼模型泪液及角膜、结膜黏蛋白1表达的影响

储俐，曹文富，马素红

干眼（dry eye）是指任何原因引起的泪液质或量异常，或动力学异常导致的泪膜稳定性下降，并伴有眼部不适和（或）眼表组织损害为特征的多种疾病的总称[1]。严重干眼者可引起视力明显下降从而影响其正常的工作和生活，甚至导致失明。我国社区人群流行病学资料[2]显示，北京市4,439名40岁及以上人群干眼的患病率为21%，随着电脑、智能手机等电子产品的普及，干眼的发病趋势逐年增加。研究[3-5]表明，眼表黏蛋白与干眼的发病密切相关。因此，改善眼表黏蛋白的表达成为治疗干眼的又一研究热点。根据中医取类比象法推测，以黏蛋白1（mucin 1，MUC1）为代表的眼表黏蛋白，其固摄、防疫等生物学功能类似中医“卫气”生理功能。本研究采用黏蛋白缺乏家兔干眼模型[6]，应用黄芪免煎颗粒对兔干眼模型进行干预，观察益卫固表药物黄芪对其泪液及角膜、结膜MUC1 蛋白表达的影响情况，为干眼的中医药治疗提供参考。

1 材料与方法

1.1 实验动物

健康成年家兔30只，购买于重庆医科大学实验动物中心[许可证号：SCXK（渝）2019-0001]，雌雄各半，体重（2.1～2.5 kg），实验条件下适应性饲养14 d后称重，按雌雄及体重大小编号。本研究实验动物及条件符合国家科学技术委员会的《实验动物管理条例》相关规定，由重庆市九龙坡区中医院动物实验福利伦理审查委员会获批（伦理审批号：JLZYLL201832）。

1.2 药品、试剂与仪器

黄芪免煎颗粒（一方颗粒医药股份有限公司，1093173），抗兔MUC1单抗（美国Abcam公司，ab104978），酶联免疫吸附（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）试剂盒（厦门科顺生物公司，KS16918），中强度裂解液（杭州弗德生物公司，FD008），苯扎氯胺（美国Sigma 公司，63449），第一链互补脱氧核糖核酸（complementary DNA，cDNA）合成试剂盒、染料法荧光定量试剂盒（日本Takara 公司，D6210A、RR820A），自发荧光淬灭剂（武汉赛维尔生物科技有限公司，s8030）。

实时荧光定量聚合酶链反应（real-time quantitative PCR，RT-qPCR）仪、凝胶成像系统（美国Bio-Rad 公司，CFX96、GelDoc2000），高速冷冻离心机（美国Sigma 公司，3K15），分光光度计（日本Shimadzu 公司，UV-2450），酶标仪（美国Biotek 公司，EON），正置荧光显微镜（日本Nikon 公司，Eclipse C1）。

1.3 建立黏蛋白缺乏兔干眼模型

实验者为同一人在同一环境中进行。随机选取20 只动物，按文献方法[6]建立黏蛋白缺乏兔干眼模型，于每天上午9:00 和晚上9:00，各1 次右眼滴0.1%苯扎氯铵2 滴，余下10 只动物于同一时间右眼以0.9%氯化钠注射液滴眼2 滴，连续28 d。28 d 后对造模动物进行泪液分泌试验（schirmerⅠtest，SⅠT），泪膜破裂时间（tear film break-up time，BUT）检测，及Elisa法检测泪液MUC1表达情况。当SⅠT＜10 mm/5 min、BUT＜10 s、泪液MUC1表达较对照组动物减少，且差异有统计学意义，则视为造模成功。

1.4 分组与给药

造模成功的动物根据随机数字表法随机分为模型组（model group，MG）和黄芪组（Astragalus membranaceus，AM），另将以0.9%氯化钠注射液滴眼的10 只动物设为对照组（control group，CG）。黄芪免煎颗粒1 g相当于黄芪饮片5 g，将6 g黄芪免煎颗粒溶于150 mL 的0.9%氯化钠注射液中，制成浓度为40 mg/mL 口服溶液。根据兔与人等效剂量换算后，AM 组以黄芪免煎颗粒口服溶液8 mL/kg 每日灌胃1 次，CG、MG 组灌胃同体积0.9%氯化钠注射液，连续28 d。

1.5 标本取材

于实验第0、28、56 d 在每组家兔右眼结膜囊内滴注0.9%氯化钠注射液20.0 μL 后，轻拉下睑结膜并微压，用毛细玻璃管吸取泪液20.0 μL，转移至0.5 mL 离心管，-20℃保存，用于Elisa 检测。于实验第56 d 处死动物，剪取右眼角膜，以及12 点钟处距角膜缘2.0 mm 的球结膜，大小约为8.0 mm×6.0 mm。角膜和结膜均于纵行中央一分为二，-80℃保存，用于RT-qPCR及免疫荧光检测。

1.6 Elisa检测兔泪液MUC1表达

建立标准曲线，取分装于0.5 mL 离心管中的泪液，用标本稀释液1∶5稀释后，根据试剂盒说明书操作剩余步骤。完成后用酶标仪在450 nm 测定光密度值，根据标准曲线换算为浓度。

1.7 RT-qPCR检测兔角膜、结膜MUC1基因表达

剪取组织样品置于离心管内，研磨充分后进行震荡和离心，把离心后的水相层转移到新的离心管中。加入乙醇后混匀，反复离心，提取RNA。测定RNA 浓度和纯度，然后配制逆转录反应体系，将RNA 逆转录成cDNA，最后进行RT-qPCR，以β-肌动蛋白（β-Actin）为内参，引物信息如表所示（表1）。

表1 引物序列

1.8 免疫荧光法检测角膜、结膜MUC1表达

依次将组织切片经过脱蜡、梯度脱水、抗原修复、洗涤、血清封闭，然后分别以MUC1 一抗（兔抗，稀释比例1∶500）和二抗（山羊抗兔，稀释比例1∶300）孵育，抗荧光淬灭后封片，于荧光显微镜下观察并采集图像，使用Image-Pro plus 6.0 软件进行图像分析。

1.9 统计学方法

采用SPSS 25.0统计软件对数据进行分析，计量资料数据采用均数±标准差（）表示，符合正态分布且方差齐的计量资料，方差分析进行多组变量间的相互比较，两两比较采用LSD-t检验。当P＜0.05时，被认为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 对泪液MUC1表达的影响

3 组间干眼兔泪液MUC1 含量，在第0 d 差异无统计学意义（P＞0.05），而在第28、56 d，差异有统计学意义（F28d=596.459，F56d=103.269，均P=0.000）。两两比较，与CG 组相比，MG 组兔第28 d 和56 d 泪液MUC1 表达降低（t28d=26.739，t56d=15.268，均P=0.000）；与MG组比较，AM 组兔第56 d泪液MUC1表达升高（t=8.031，P=0.000），差异均有统计学意义（表2）。

表2 3组泪液中MUC1表达的比较（，ng/mL，n=10）

表2 3组泪液中MUC1表达的比较（，ng/mL，n=10）

注：* 与CG 组比较，P＜0.05；# 与MG 组比较，P＜0.05；CG 对照组；MG 模型组；AM 黄芪组；MUC1 黏蛋白1

2.2 对角膜、结膜MUC1基因表达的影响

CG 组MUC1 基因相对表达量为（0.99±0.10），MG 组为（0.21±0.08），AM 组为（0.40±0.06），3 组间MUC1 基因表达比较，差异有统计学意义（F=254.774，P=0.000）。两两比较，与CG 组比较，MG 组MUC1 基因表达降低（t=19.261，P=0.000）；与MG组比较，AM组MUC1基因表达升高（t=6.008，P=0.000），差异均有统计学意义。

2.3 对角膜、结膜MUCI蛋白表达的影响

免疫荧光染色结果显示，MG 组角膜上皮细胞周围和角膜表面可见少量MUC1表达，AM组角膜上皮细胞周围和角膜表面可见密集MUC1 表达，角膜基质层也出现密集表达（图1A、1B）。MG 组杯细胞周围可见少量MUC1表达，AM组结膜表面和杯细胞周围可见密集MUC1 表达，并在结膜表面集聚（图1C、1D）。MG 组兔角膜、结膜MUC1 表达分别为6.60±2.65、23.35±5.48，AM 组角膜、结膜MUC1 表达分别为14.28±4.59、36.47±3.55，与MG 组比较，AM组角膜、结膜MUC1 表达均升高（t角膜=4.582，t结膜=6.354，均P=0.000），差异有统计学意义。

3 讨论

眼表黏蛋白与干眼的发病密切相关[3-5]。黏蛋白是一个高分子量的糖蛋白家族，是泪膜的重要组成成分[7]。目前存在于眼表的黏蛋白主要有7种，分别为MUC1、MUC2、MUC4、MUC5AC、MUC5B、MUC7和MUC16。其中MUC1 是角膜和结膜上皮细胞表达的主要跨膜黏蛋[8-9]。眼表黏蛋白的主要生理功能有：（1）对泪液的固摄作用，MUC1 的亲水端可以吸附泪膜中的水分，在眼表形成一个厚约500 nm 的细胞表面多糖与蛋白质的复合物，对眼表泪膜形成固摄作用[10]；（2）防御作用，早期的实验[11]已经证实黏蛋白作为受体能捕捉过敏原和病原微生物，通过泪道引流系统把它们从粘膜表面清除掉，人角膜上皮细胞中的跨膜型黏蛋白的屏障保护作用阻止了荧光素钠向眼内的渗透[12-13]，在其他粘膜表面黏蛋白也具有同样的细胞表面屏障保护作用[14-15]；（3）细胞内外信号传导作用。MUC1 与细胞浆内肽链的酪氨酸残基磷酸化后，通过与包含Src同源2片段的蛋白相互作用而发挥信号传导作用[16]；同时其类似表皮生长因子的片段可以作为配体，调节酪氨酸激酶受体2的活性，从而调节上皮细胞的生长[17]。

《黄帝内经·灵枢经》[18]云：“卫气者，所以温分肉，充皮肤，肥腠理，司开阖者也。”运用取类比象法，以MUC1为主的眼表跨膜黏蛋白的生物学功能，如防御、固摄等，类似中医“卫气”的生理功能。其通过细胞内外信号传导促进细胞生长的作用也类似于气的基本生理功能（推动和气化作用）。临床上，笔者的导师在干眼的治疗中发现在经验方中加大黄芪的用量能更快改善患者的眼部症状。黄芪，甘、微温，是中药中主要的益卫固表药，在各种中医理论著作和本草著作中均有黄芪益卫固表的功效论述。例如《药鉴》[19]云：“黄芪……其用有四：温分肉而实腠理，益元气而补三焦，内托阴证之疮疡，外固表虚之盗汗。”《汤液本草》[20]述：“东垣云，黄芪、人参、甘草三味，退热之圣药也……黄芪补三焦、实卫气”。《本草汇言》[21]云：“黄芪，补肺健脾，实卫敛汗……”等。历代医家皆认为黄芪补益卫气，为益卫固表要药。近代药理学研究[22-23]也发现，黄芪具有免疫调节、抗氧化、抗炎、抗癌、降血脂、降血糖、保肝等作用，在各种氧化应激相关疾病模型中对心、脑、肾、肠、肝和肺损伤具有一定的保护作用。

本研究结果显示，与CG 组比较，MG 组的角膜、结膜MUC1 基因和蛋白及泪液MUC1 表达均降低，表明成功建立兔黏蛋白缺乏型干眼模型。与MG 组比较，AM 组兔角膜、结膜MUC1 基因、MUC1 蛋白和56 d 泪液MUC1 蛋白表达均升高，表明黄芪在一定程度上能修复干眼兔眼表MUC1 基因和蛋白的表达，同时改善泪液中黏蛋白的缺乏状态，对干眼起到一定治疗作用。这一结论也在本研究的角膜、结膜免疫荧光染色定位分析中得到证实。因此，本研究发现黄芪能够对干眼的眼表黏蛋白损伤起到一定修复作用。由前述文献可以初步推测，中药黄芪通过其补益卫气作用，促进了眼表类似“卫气”生物学功能样蛋白MUC1 的表达。其次，多项研究[24-25]已经证实，自身免疫性疾病、眼表过敏性疾病、眼表感染性疾病等都会导致眼表黏蛋白表达的异常而产生干眼。中药黄芪的药理研究[22-23]也表明，其具有免疫调节、抗炎等多靶点作用，能够改善多种炎症及免疫损伤。因此，黄芪免煎颗粒对眼表MUC1的促进作用也可能是通过免疫调节及抗炎途径来实现的。

综上所述，本研究发现黄芪免煎颗粒能提高家兔干眼模型泪液和角膜、结膜MUC1的表达，并促进MUC1 蛋白在眼表集聚，从一定程度上修复干眼眼表黏蛋白损伤，为黄芪在干眼治疗中的运用提供参考。