通窍活血汤对兔视网膜分支静脉阻塞模型骨桥蛋白和炎症因子表达的影响

吴紫雯，张磊，杜佳伦，林恺，李沭岩，金熙

视网膜静脉阻塞（retinal vein occlusion，RVO）是发病率仅次于糖尿病视网膜病变的常见视网膜血管性疾病，以阻塞静脉远端迂曲扩张、阻塞点附近视网膜出血、水肿、渗出为临床特征[1-2]，可分为视网膜中央静脉阻塞和视网膜分支静脉阻塞（brach retinal vein occlusion，BRVO）。RVO 的病理过程在于视网膜微血管异常，缺血缺氧致视网膜新生血管（retinal neovascularization，RNV）形成。既往研究[3-5]表明，骨桥蛋白（osteopontin，OPN）与炎症因子在肿瘤的发生、发展和转移，特别是肿瘤新生血管的形成中起到了重要作用。RVO 属于中医学“络瘀暴盲”的范畴，为血瘀之证[6]，而通窍活血汤（Tongqiao HuoxueDecoction，TQHX）具有活血化瘀通窍的功效。故本研究通过建立兔BRVO 模型，进一步探讨TQHX 对视网膜组织中OPN 和白细胞介素-6（interleukin-6，IL-6）、白细胞介素-8（interleukin-8，IL-8）以及玻璃体中IL-6、IL-8表达的影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物

选择健康成年清洁级新西兰白兔30 只，雄性，体重2.5～3.0 kg，兔龄12～16 个月，由上海市海军特色医学中心动物房提供[许可证号SYXK（沪）2019-0019]。本研究实验动物及实验条件符合国家科学技术委员会的《实验动物管理条例》相关规定，由上海中医药大学实验伦理委员会批准（伦理审批号：PZSHUTCM201030011）。

1.2 试剂、药品和仪器

重组OPN、IL-6、IL-8 蛋白（上海雅酶生物科技有限公司，QY-H10080、ERB0068、ERB0069），组织蛋白裂解液（radio immunoprecipitation assay，RIPA）裂解液（美国Sigma 公司，PM12046），5%脱脂奶粉（美国BD 公司，SCQC0008S），OPN、IL-6、IL-8、β-Actin兔抗单克隆抗体一抗（上海雅酶生物科技有限公司，WB0221、WB0124、WB6002、CTS2118S），辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔二抗（碧云天生物技术公 司，A0209），兔抗IL-6、IL-8 酶联免疫吸附（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）试剂盒（武汉菲恩生物科技有限公司，RB0068F121、RB0069F121），注射用盐酸替来他明与盐酸唑拉西泮混合液（法国维克公司，7T78A）。眼底532 nm 激光治疗仪、眼底数码相机和眼底血管造影仪（德国蔡司公司，532S、VISUCAM）。

TQHX 水煎剂的组成：麝香0.15 g、桃仁3 g、红花9 g、赤芍3 g、川芎3 g、老葱5 g、大枣10 g、生姜9 g、黄酒250 mL。取上述饮片，按总体积4 倍量水浸泡30 min，加热煎煮40 min，滤取煎液；药渣再加总体积2倍量水煎煮40 min，收集滤液，将2次煎液合并，煎制成浓缩液，标记后放置在4℃冰箱冷藏保存。

1.3 兔BRVO模型建立

双眼散瞳，称取兔体重，确定麻醉剂量，采用盐酸替来他明与盐酸唑拉西泮混合液按照1 mL/kg 进行臀部肌肉注射，待兔全麻成功后于兔耳缘静脉留置头皮针。将麻醉好的实验兔置于激光机前，放置三面镜观察眼底情况，找出与视网膜动脉相伴行的静脉，采用激光（波长532 nm，能量100～200 mw，光斑直径100～200 μm，曝光时间0.1～0.2 s）在距离视盘0.5 视盘直径（papillary diameter，PD）的分支静脉处光凝。每支血管平均光凝约30点，避开伴行的动脉，每只眼选择视乳头一侧分支静脉激光封闭。激光光凝结束后，立即行眼底荧光血管造影（fluorescein fundus angiography，FFA）检查，可观察到视网膜分支静脉完全阻塞。造模后送回动物房饲养，禁水禁食12 h。建模后14 d再行FFA，未见血管再通可视为造模成功。正常对照兔实行相同造模的假手术，但无需进行激光封闭，饲养过程完全同造模动物一致。

1.4 动物分组与喂养

将造模成功的20 只BRVO 兔随机分为模型组（model group，MG）和TQHX 组，另将进行假手术的兔设为对照组（control group，CG），每组10 只。按照人与兔的等效计算[7]，得出兔的生药剂量为2.3 g/kg，给药剂量则为5.75 g/kg，CG、MG 组灌胃等体积蒸馏水，每日1次，连续给药21 d。

1.5 标本采集

给药21 d 后，过量麻醉处死。立即摘除眼球，显微镜下抽取玻璃体，分离视网膜组织，放入EP 管中移至-80℃冰箱保存备用。

1.6 Western Blot检测视网膜组织中OPN、IL-6、IL-8表达

从视网膜组织中提取蛋白，用酶标仪测定蛋白浓度，经凝胶、电泳和转膜后用5%脱脂奶粉室温封闭1 h，洗膜后分别加入OPN、IL-6、IL-8一抗（兔抗，稀释比例1∶100）以及内参蛋白β-Actin 一抗（兔抗，稀释比例1∶1,000），4℃孵育过夜。洗涤3 次再加入二抗（山羊抗兔，稀释比例1∶10,000），室温孵育40 min，洗涤3 次后化学发光显影并拍照。Alpha View SA 软件分析目标条带灰度值，目标条带蛋白水平=目标条带灰度值/β-Actin灰度值。

1.7 ELISA检测兔玻璃体中IL-6、IL-8表达

将玻璃体以1,000 rpm 离心20 min，收集上清液。采用ELISA 法检测兔玻璃体液中IL-6、IL-8 水平，操作步骤严格按照试剂盒操作说明进行。

1.8 统计学分析

采用SPSS 21.0统计软件对数据进行分析，计量资料数据采用均数±标准差（）表示，符合正态分布且方差齐的计量资料，方差分析进行多组变量间的相互比较，两两比较采用LSD-t检验。当P＜0.05时，认为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 TQHX对BRVO兔视网膜OPN、IL-6、IL-8表达的影响

3 组间BRVO 兔视网膜OPN、IL-6、IL-8 水平比较，差异均有统计学意义（FOPN=13.170，FIL-6=50.920，FIL-8=48.780，均P=0.000）。两两比较，（1）OPN：与CG 组比较，MG 组兔视网膜OPN 表达升高（t=-6.903，P=0.000）；与MG 组比较，TQHX 组兔视网膜OPN 表达降低（t=3.479，P=0.003），差异均有统计学意义。（2）IL-6：与CG 组比较，MG 组兔视网膜IL-6表达升高（t=-8.006，P=0.000）；与MG组比较，TQHX组兔视网膜IL-6 表达降低（t=6.971，P=0.000），差异均有统计学意义。（3）IL-8：与CG 组比较，MG 组兔视网膜IL-8 表达升高（t=-8.908，P=0.000）；与MG组比较，TQHX 组兔视网膜IL-8 表达降低（t=5.097，P=0.000），差异均有统计学意义（图1、表1）。

2.2 TQHX 对BRVO 兔玻璃体IL-6、IL-8表达的影响

3 组间BRVO 兔玻璃体IL-6、IL-8 水平比较，差异均有统计学意义（FIL-6=12.640，P=0.000；FIL-8=8.816，P=0.001）。两两比较，（1）IL-6：与CG 组比较，MG 组兔玻璃体IL-6 表达升高（t=-4.725，P=0.000）；与MG 组比较，TQHX 组兔玻璃体IL-6 表达降低（t=3.380，P=0.003），差异均有统计学意义。（2）IL-8：与CG 组比较，MG 组兔玻璃体IL-6表达升高（t=-3.899，P=0.001）；与MG 组比较，TQHX 组兔玻璃体IL-8 表达降低（t=2.328，P=0.032），差异均有统计学意义（表1）。

表1 TQHX对BRVO兔视网膜OPN、IL-6、IL-8表达的影响（，n=10）

表1 TQHX对BRVO兔视网膜OPN、IL-6、IL-8表达的影响（，n=10）

注：*与CG组比较，P＜0.05；#与MG组比较，P＜0.05；CG 对照组；MG 模型组；BRVO 视网膜分支静脉阻塞；TQHX 通窍活血汤；OPN 骨桥蛋白；IL-6 白细胞介素-6；IL-8 白细胞介素-8

3 讨论

RVO 是一类由于各种原因导致血管内皮受损，血液流变学、血流动力学改变的视网膜血管疾病。目前根据国内研究[8]报道，RVO的患病率为0.77%～1.6%。关于RVO的具体发病机制尚未完全明确，其中BRVO多与高脂血症、视网膜动脉硬化有关，上述因素均会引起静脉血流变缓，发生瘀滞或阻塞，使血液回流受阻，导致静脉高压，破坏血管通透性，造成缺血缺氧的状态[9]。有研究[10-11]报道，增殖性视网膜病变患者玻璃体内OPN 的含量高于非增殖性视网膜病变患者。还有研究[12-13]显示，在缺氧条件下培养的内皮细胞中，随着缺氧时间的增长，IL-6 mRNA 的表达水平增高，推测长时间的缺氧可能刺激内皮细胞分泌IL-6；而缺血型RVO 眼内房水中IL-8的表达水平高于非缺血型，推测在RVO发生过程中，炎症因子与血管内皮生长因子之间的平衡破坏，新生血管增多，导致视网膜缺血缺氧加重[14-15]。OPN 作为一种可溶性促炎因子，能促进炎症、组织重塑、纤维化及新生血管的形成[16-17]。但是OPN、IL-6、IL-8是否参与RVO的发生发展尚不明确。

中医学认为，RVO 的基本病机为脉络瘀阻，血不循经，溢于目内，其中血瘀是RVO 最突出的病机。RVO 的致病因素或为情志内伤、肝气郁结；或为肝肾阴亏、肝阳上亢；或为过食肥甘厚味、痰湿内生[18]。气血同源，精血同源，气为血之帅，血为气之母，气滞则津血运行受阻，气不行津，津液凝聚而生痰，阻遏气机，使血液无法正常运行而形成瘀血，痰瘀互结，导致眼部功能受损[19]。TQHX 中川芎、桃仁、红花、赤芍用于活血化瘀，瘀散则血行通畅，并且具有抗凝、抗炎、扩血管以及改善微循环的功能；麝香为君药，气味芳香走窜，开通诸窍，活血通络；老葱辛散，通阳入络；麝香与大葱二药借酒性之行走，散瘀通窍；生姜、大枣调和营卫，以助生化之源。诸药合用，共奏祛瘀生新，活血通窍之功效，可全面调理脏腑及阴阳升降功能，以改善视网膜微循环障碍[20-21]。因此，本研究从“瘀血”入手，治法以“活血化瘀通络”为主，通过动物实验来探讨TQHX 对兔BRVO 模型中OPN与炎症相关因子表达的影响。

本实验研究显示，与CG组比较，MG组兔视网膜组织中OPN、IL-6、IL-8的表达升高，玻璃体中IL-6、IL-8 的表达也升高，推测OPN 和IL-6、IL-8 可能参与了BRVO的发生发展，并且OPN与IL-6、IL-8之间可能具有相关性。视网膜在缺血缺氧状态下，局部微循环的改变可能诱导多种细胞产生OPN 和IL-6、IL-8，导致其在细胞内的表达增加。对BRVO 兔采用TQHX 干预，TQHX 组与MG 组比较，视网膜组织中OPN、IL-6、IL-8的表达下降，玻璃体中IL-6、IL-8的表达水平也下降，推测TQHX 可以改善视网膜微循环，缺血缺氧状态缓解后OPN 以及炎症相关因子的表达水平下降。

综上所述，本研究发现TQHX 对BRVO 兔视网膜OPN、IL-6、IL-8 以及玻璃体IL-6、IL-8 的表达具有抑制作用，能够改善炎症反应，可为临床早期防治BRVO提供实验依据。