口服滋肾健脾化瘀片联合抗VEGF治疗对DR患者房水细胞因子影响的研究

滕月，曾筱婷，罗英子，刘红，阳艳，关国华，俞晓艺

糖尿病视网膜病变（diabetic retinopathy，DR）是糖尿病的主要并发症之一，其中严重的非增殖性DR（nonproliferative diabetic retinopathy，NPDR）和增殖性DR（proliferative diabetic retinopathy，PDR）以及临床显著性黄斑水肿一旦发生，将严重威胁患者的视觉健康[1]。细胞因子作为一类多功能细胞生长调节因子，能够与靶细胞表面的特异性受体结合，单独或协同发挥其生物学效应，具有很强的生物学活性，极微量即可发挥作用[2]。房水中包含多种细胞因子，这些细胞因子由视网膜产生并通过多种途径进入到房水循环中，可在一定程度上反映其在眼内组织的表达情况。其中，血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）是DR 病理生理过程中的一个重要因子，缺氧、氧化应激、炎症等病理条件可能导致VEGF 上调，进而引起渗漏、血管增生等病理改变，抗VEGF治疗在DR治疗中占据越来越重要的地位。滋肾健脾化瘀片是广州中医药大学第一附属医院院内制剂，是一种治疗气阴两虚、络脉瘀阻型糖尿病视网膜病变的专病专方，本研究通过观察气阴两虚，络脉瘀阻型DR 患者口服滋肾健脾化瘀片联合玻璃体腔注射康柏西普（intravitreal conbercept，IVC）治疗前后房水细胞因子的变化，探讨该治疗方法对房水细胞因子的影响。

1 对象与方法

1.1 研究对象

纳入2019 年3 月1 日—12 月31 日期 间在广州中医药大学第一附属医院眼科住院治疗需行抗VEGF 治疗的气阴两虚，络脉瘀阻型DR 患者32 例（42只眼）作为DR 组，其中男性21例，女性11例，平均年龄（56.41±12.07）岁。DR 组42 只眼中，NPDR 16 只眼（39.10%），PDR 26 只眼（61.90%），伴有黄斑水肿的共19只眼（45.24%），曾接受过全视网膜光凝患眼17 只眼（40.48%）。收集同期在同医院眼科住院需行白内障手术的患者作为对照组27 例（31 只眼），其中男性11 例，女性16 例，平均年龄（68.70±7.23）岁。2组性别差异无统计学意义（P＞0.05），而年龄差异有统计学意义（t=-5.855，P=0.000）。

1.2 诊断标准

DR 诊断标准[3]：（1）有明确的糖尿病病史；（2）眼底像有典型的微血管瘤、出血、渗出、新生血管、黄斑水肿等表现；（3）排除其他原因所致的类似视网膜病变。DR 分期标准[3]：NPDR 分为，（1）I 期(轻度非增生期，Mild NPDR)，仅有毛细血管瘤样膨出改变；（2）II期(中度非增生期，Moderate NPDR)，介于轻度到重度之间的视网膜病变，可合并视网膜出血、硬性渗出和(或)棉絮斑；（3）III 期(重度非增生期，Severe NPDR)，每象限视网膜内出血≥20 个出血点，或者至少2 个象限已有明确的静脉串珠样改变，或者至少1 个象限视网膜内微血管异常(intraretinal microvascular abnormalities，IRMA)，无明显特征的增生性DR。PDR 分为，（1）Ⅳ期(增生早 期，early PDR)，出现视网膜新生血管(neovascular elsewhere，NVE)或视乳头新生血管(neovascular of the disc，NVD)，当NVD＞1/4～1/3 视乳头直径(disc diameter，DD)或NVE＞1/2 DD，或伴视网膜前出血或玻璃体出血时称“高危增生型”(high risk PDR)；（2）V 期(纤维增生期，fibrous proliferation)，出现纤维膜，可伴视网膜前出血或玻璃体出血；（3）Ⅵ期(增生晚期，advanced PDR)，牵拉性视网膜脱离，合并纤维膜，可合并或不合并玻璃体积血，也包括虹膜和房角的新生血管。

中医辨证分型标准[4]：（1）气阴两虚，络脉瘀阻证。症状包括视物模糊，目睛干涩，或视物变形，或眼前黑花飘舞，神疲乏力，气短懒言，口干咽燥，自汗，便干或稀溏，舌胖嫩、紫暗或有瘀斑，脉沉细无力；（2）肝肾亏虚，目络失养证。症状包括视物模糊，目睛干涩；头晕耳鸣，腰膝酸软，肢体麻木，大便干结，舌暗红少苔，脉细涩；（3）阴阳两虚，血瘀痰凝证。症状包括视力模糊，目睛干涩或严重障碍；神疲乏力，五心烦热，失眠健忘，腰酸肢冷，手足凉麻，阳痿早泄，下肢浮肿，大便溏结交替；舌淡胖少津或有瘀点，或唇舌紫暗，脉沉细无力。

1.3 纳入标准

DR 组：（1）确诊为2 型糖尿病患者；（2）已明确DR 的诊断及分期；（3）中医辨证为气阴两虚，络脉瘀阻型；（4）需要住院行抗VEGF 治疗的患者。对照组：同期因晶状体混浊影响生活需行白内障超声乳化联合人工晶体植入术的患者。

1.4 排除标准

DR 组：（1）同时伴有其它眼部血管性疾病和炎症性疾病者，如视网膜动脉、静脉阻塞、年龄相关性黄斑变性、息肉样脉络膜新生血管病变、葡萄膜炎、青光眼等；（2）出于前房穿刺安全性考虑，前房中轴深小于2.5 mm，角膜内皮细胞数量小于2,000个/mm²者；（3）伴有角膜病变者，包括翼状胬肉超过角膜缘2 mm、角膜新生血管等；（4）3 个月内曾行抗VEGF治疗或糖皮质激素眼内注射治疗或视网膜激光光凝治疗者；（5）伴有严重的器质性病变患者（如严重的心脏病、肝肾功能衰竭、肿瘤）。对照组：（1）糖尿病患者，或血糖异常患者；（2）有玻璃体切除手术者；（3）曾行视网膜激光光凝术者；（4）余同DR 组（1）～（5）。

1.5 剔除标准

（1）送检房水因样本含量太少，检测结果欠准确，予以剔除；（2）因病情变化，改变治疗方案的病例；（3）因个人原因未完成本方案观察周期的失访者。

1.6 治疗方案

DR 组患者给予玻璃体腔注射康柏西普（IVC）后，联合口服滋肾健脾化瘀片治疗，8 周后再次行抗VEGF 治疗。滋肾健脾化瘀方由黄芪、葛根、三七、山茱萸、石决明、制乳香、蕤仁肉等组成，根据此方制成片剂，每次口服6片，每日2次。

1.7 取材与标本检测

1.7.1 房水采集及药物注射（1）DR 组：玻璃体腔注药联合前房穿刺术。房水取样，在手术室无菌条件下进行，用胰岛素注射器由角膜缘内1.0 mm 小心穿刺进入前房，不触及晶状体、虹膜、角膜内皮，抽取0.1 mL 房水，收集在无菌管后立即存放在液氮罐中，以待检测。玻璃体腔注药，使用1 mL 注射器于10 点钟位角膜缘外3.5 mm 垂直于眼球穿刺，注入抗VEGF 药物康柏西普（朗沐，10 mg/ml，0.2 ml/支）0.05 mL，拔除注射针头，并压迫穿刺口30 s，滴复方妥布霉素地塞米松眼药水、涂复方妥布霉素地塞米松眼膏，无菌纱布包封术眼。（2）对照组：无菌手术室中，在白内障超声乳化手术时，用15°穿刺刀在2 点钟方位做侧切口后，用胰岛素注射器由侧切口处进入前房，不触及晶状体、虹膜、角膜内皮，取0.1 mL房水。房水收集在无菌管后立即存放在液氮罐中，以待检测。（3）标本分组：对照组标本设为A 组，DR治疗前标本设为B组，DR治疗后标本设为C组。

1.7.2 房水细胞因子检测 采用Luminex 液相芯片技术检测房水细胞因子浓度，包括血管内皮生长因子A（VEGF-A）、胎盘生长因子（placental growth factor，PLGF）、血小板源性生长因子（platelet derived growth factor,PDGF）亚型（PDGF-AA 和PDGF-BB）、血管生成素样蛋白4（angiopoietin-like 4，ANGPTL4）、白细胞介素（interleukin，IL）亚型（IL-1β、IL-6 和IL-8）、单核细胞趋化蛋白-1（monocyte chemotactic protein-1，MCP-1）、细胞间黏附分子-1（intercellular cell adhesion molecule-1，ICAM-1）和肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）浓度。检测试剂盒（Human Premixed Multi-Analyte Kit）购自广州欣励和生物科技有限公司，严格按照说明书进行操作。主要步骤：将房水标本10,000 rpm，离心10 min，取上清，取50 μL 样本进行检测。标准品准备：按说明预混标准品得到S1，涡旋30 s 混合，静置5 min，3 倍稀释标准品S1-S7，将标准品稀释液作为Background（空白对照）。取微珠在振荡器上振荡，超声，稀释微珠；再次震荡，洗涤3次；取标准品、样品和Background 加入96 孔板中，封膜，振荡，避光，室温孵育。加入恢复至室温的检测抗体25 μL，封板，避光震荡孵育2 h，加入25 μL 链霉亲和素-藻红蛋白，封板，避光震荡孵育30 min。弃去检测抗体，洗涤3次；每孔加入50μL稀释好的Streptavidin-PE，封膜，振荡，室温避光孵育30 min；洗涤3 次；每孔加入100 μL Wash Buffer 重悬，贴上封口膜，放置在平板摇床上震荡，室温避光振荡2 min；送入已校正的Luminex 200机器中读值。

1.7.3 数据采集 本次实验检测的样品与标准品经Luminex 200 检测仪检测后，获得的荧光由软件自动计算与优化，形成Excel 格式的输出文件，将每例样品检测的原始荧光代入标准曲线公式，计算获得样品浓度，浓度单位为pg/mL。本次实验中，Recovery 值，即检测值（observed concentrations，根据标准曲线计算得到）与期望值（expected concentrations，试剂盒提供）的比值在80～120 之间，本次实验标准品结果符合试剂盒要求。

1.8 统计学方法

采用SPSS 25.0对数据进行统计学分析，计量资料进行Shapiro-Wilk 正态性检验，对服从正态分布的，用均数±标准差（）表示，两样本组间比较采用独立样本t检验，两两配对样本应采用配对t检验；不服从正态分布的，用中位数及四分位数[M(Q1,Q3)]表示，对两个独立样本采用Wilcoxon 秩和检验，对多个独立样本比较采用Kruskal-Wallis 检验，组间两两比较进行Bonferroni 校正。若P＜0.05，认为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 房水中VEGF家族细胞因子变化

对照组（A 组）VEGF-A、PLGF 浓度均低于DR 组治疗前（B 组），差异有统计学意义（ZVEGF-A=-4.553，ZPLGF=-3.588，均P=0.000）；VEGF-A 治疗后（C 组）浓度低于治疗前（B 组），差异有统计学意义（ZVEGF-A=-5.608，P=0.000）；PLGF 治疗前后比较，差异无统计学意义（P＞0.05）（表1）。

2.2 房水中PDGF家族细胞因子变化

DR 组治疗前（B 组）PDGF-AA 浓度高于对照组（A 组），差异有统计学意义（Z=-4.464，P=0.000）；而与治疗后（C 组）比较，差异无统计学意义（P＞0.05）（表1）。

2.3 房水中ANGPTL4水平变化

DR 组治疗前（B 组）ANGPTL4 浓度高于对照组（A 组），差异有统计学意义（Z=-7.265，P=0.000）；而与治疗后（C 组）比较，差异无统计学意义（P＞0.05）（表1）。

表1 3组房水中VEGF、PDGF家族细胞因子及ANGPTL4水平比较［M（Q1，Q3）］

2.4 房水中炎性因子水平变化

DR 组治疗前（B 组）IL-6、IL-8、MCP-1、ICAM-1、TNF-α 浓度高于对照组（A 组），差异有统计学意义（ZIL-6=-4.488，ZIL-8=-5.770，ZMCP-1=-5.100，ZICAM-1=-3.625，均P=0.000；ZTNF-α=1.995，P=0.046）；IL-8 浓度治疗后（C 组）高于治疗前（B 组），差异有统计学意义（Z=-2.907，P=0.004），余因子治疗前后比较，差异无统计学意义（P＞0.05）（表2）。

表2 3组房水中炎症因子水平比较［M（Q1，Q3）］

3 讨论

DR 发病机制复杂，至今尚未完全阐明，研究已表明多种病理反应与血管内皮生长因子和炎症因子关系密切[5]。本研究选取的房水细胞因子大致可以分为4类：VEGF家族包括VEGF-A 和PLGF；PDGF家族包括PDGF-AA、PDGF-BB；ANGPTL4；炎症因子包括IL-6、IL-8、IL-1β、MCP-1、ICAM-1、TNF-α。本研究中，DR 组治疗前在VEGF-A、PLGF、PDGF-AA、ANGPTL4、IL-6、IL-8、MCP-1、ICAM-1、TNF-α 水平上均高于对照组，有统计学意义，提示上述细胞因子参与了DR 的病理过程。由于DR 的发病年龄近年来趋于年轻化，导致本研究中纳入的2组在年龄上存在显著差异，研究[6-9]显示，在年龄相关性白内障患者的房水中，VEGF 家族、PDGF 家族和炎症因子含量有上升趋势，糖尿病性白内障组患者房水和血清中VEGF 的表达水平显著高于非糖尿病性白内障组患者[10]，本研究中DR组相关因子的浓度高于对照组（白内障患者），差异具有研究意义。

VEGF 广泛存在于各种生理条件下，高糖状态下，低氧、氧化应激和炎症反应等都能诱导其表达增加。本研究中DR 组在治疗后VEGF-A 浓度低于治疗前，甚至低于对照组。可能是由于康柏西普与VEGF-A 的亲和力强，比与VEGF-B167 和PLGF 的亲和力高30倍，约是雷珠单抗的30倍[11]。本研究显示PLGF在治疗后无明显下降，与周骏等[12]研究得出经康柏西普注药后房水中PLGF 显著降低不同，周骏等使用ELISA 检测，不同检测方法可能对样本敏感性不同。

PDGF 是另外一大类促血管生成的细胞因子，PDGF 高亲和力拮抗剂E10030，可与PDGF 结合而阻断其与PDGFR-β 的结合，研究显示通过眼内注射1.85 μg抗PDGF-BB 重组蛋白能有效抑制局部缺氧而诱发的视网膜新生血管[13]。抗PDGF 药物未来可能会是治疗视网膜新生血管新方向，而其与抗VEGF药物联用将会是一个新的治疗思路。

IL-8 作为一种促炎性因子，具有破坏血-视网膜屏障，促血管生成和促肿瘤发展的作用。丁国龙等[14]研究PDR 患者经贝伐单抗注射后IL-8 细胞因子较注射前显著增加，与本研究结果一致，推测IL-8升高可能是由于前房穿刺导致一系列炎症反应所致，也可能是VEGF 被抑制后代偿性引起IL-8 升高。本研究中TNF-α治疗前后变化不明显，IL-6在治疗后有一定程度的降低，但差异无统计学意义。刘求红等[15]对口服滋肾健脾化瘀片前后的NPDR 患者外周血中TNF-α、IL-6 等因子进行检测，发现服药后患者外周血中TNF-α、IL-6 明显降低，提示全身血浆与房水中特定细胞因子含量变化规律可能存在差异[16]。

既往研究[17]发现，抗VEGF 联合口服中药能延长眼内注药的间隔时间，减少注药次数，延缓病情进展。滋肾健脾化瘀片由黄芪、葛根、三七、山茱萸、石决明、制乳香、蕤仁肉等药物组成，临床研究中发现，该药具有视网膜血管及神经保护作用，能够提高DR 患者视野的平均光敏感度、平均缺损、丢失方差[14]，提高视网膜电图振荡电位振幅、改善视网膜内层血液循环[18]，并能有效提高视力、减轻黄斑水肿，尤其是联合视网膜激光光凝或联合眼内注射贝伐单抗治疗时，疗效更佳[19]。该药能够提高DR伴黄斑水肿患者血清NOS活性、抑制血清VEGF、IL-6含量，发挥保护视网膜血管内皮、改善视网膜灌注的作用[20]。其作用可能与该方主要成分有关，黄芪具有减少视网膜周细胞凋亡、抑制视网膜氧化应激反应的作用，其主要成分黄芪多糖通过抑制TNF-α、ICAM-1 表达起到抗炎作用来保护视网膜，同时通过抑制视网膜中的VEGF 和磷酸化蛋白激酶（phosphorylated protein kinase，p-Akt）来抑制新生血管的形成[21-22]。葛根中的葛根素可以清除氧自由基，改善视网膜组织的血液循环，可以通过抑制VEGF 和血小板内皮细胞粘附分子-1（platelet endothelial cell adhesion molecule-1，PECAM-1)的表达来减少新生血管的渗漏[23-24]。三七具有抗炎、降血脂、抗氧化等作用，可以缩短凝血时长，抑制血管通透性的增加，从而改善微循环[25]，通过玻璃体腔注射其主要成分三七总皂苷，可能通过下调视网膜VEGF-A、低氧诱导因子-α（hypoxia induced factor α，HIF-α）mRNA 的表达来改善由于缺氧导致的视网膜新生血管[26]。本研究认为该药在抗VEGF 治疗后对于维持眼内房水因子的稳定方面可能具有辅助作用，本团队也将对其继续深入研究。

本研究将宏观与微观相结合，在病证结合理论基础上治疗糖尿病视网膜病变的思路值得在临床上推广应用，并为该病的中西医结合治疗提供了一定的理论依据。