达托利司抑制替莫唑胺耐药恶性胶质瘤细胞增殖的机制研究

彭潇 饶杰 吴慧华 项已桉

恶性胶质瘤是常见的原发性颅内肿瘤，患者预后不良，中位生存期仅14.6个月，3年生存率仅为10%[1]。外科手术联合术后同步放化疗是恶性胶质瘤的标准治疗方案。替莫唑胺（temozolomide,TMZ）是恶性胶质瘤常用的化疗药物，但随着化疗进行，大部分患者最终会对TMZ耐药[2]。TMZ的耐药机制复杂，是不同机制相互作用的结果。除了DNA损伤修复，肿瘤微环境重塑、表观遗传学改变、信号通路持续活化等均可导致恶性胶质瘤细胞对TMZ耐药[2-3]。表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor,EGFR）及其突变体在恶性胶质瘤组织和细胞中呈异常高表达，可促进恶性胶质瘤细胞增殖、迁移和耐药[4]。EGFR介导的恶性胶质瘤耐药与其持续激活磷脂酰肌醇-3-激酶（phosphatidylinositol 3-kinase,PI3K）信号通路有关[5]。达托利司（dactolisib,DAC）是一种能够干扰PI3K和哺乳动物雷帕霉素靶点复合物活性的小分子抑制剂，研究表明DAC能够显著抑制肿瘤细胞增殖[6-8]，但对TMZ耐药的影响及机制尚未完全明确。本研究探讨DAC抑制TMZ耐药恶性胶质瘤细胞增殖的机制，现将结果报道如下。

1 材料和方法

1.1 材料 DAC（纯度：＞98%，分子量：400.4648，批号：S117968）购自上海阿拉丁公司，杜尔伯科改良伊格尔培养基、青霉素-链霉素双抗、FBS、胰蛋白酶购自美国Gibco公司，EGFR（批号：ab52894）、B细胞淋巴瘤（B cell lymphoma 2,Bcl-2，批号：ab241548）、切割半胱氨酸蛋白酶 3（Cleaved-Caspase 3，批号：ab214430）和β-actin（批号：ab6276）抗体均购自上海Abcam公司。细胞活性与细胞毒性检测试剂盒（批号：C2015S）、赫斯特染料（批号：C1011）购自上海碧云天生物技术有限公司。Trizol试剂购自美国Invitrogen公司，Prime Script RT Master Mix试剂盒（批号：RR36A）、SYBR Premix Ex TaqTMⅡ试剂盒（批号：RR820A）购自宝日医生物技术（北京）有限公司。U251细胞购自中国科学院细胞库。本研究经医院医学伦理委员会批准[批准文号：科研伦审（2020）第（232）号]。

1.2 方法

1.2.1 耐药细胞模型的建立 采用浓度梯度递增法，将1×105个U251细胞接种于含有10%FBS的杜尔伯科改良伊格尔培养基，置于5%CO2、饱和湿度、37℃恒温细胞培养箱中培养，细胞贴壁后更换含有1 μmol/L TMZ的培养基，24 h后更换无TMZ培养基继续培养，待细胞恢复生长且状态良好后，重复上述操作继续增加TMZ药物浓度，直至细胞能在含有10 μmol/L TMZ的培养基正常生长时，停止诱导，获得稳定耐药细胞株，即TMZ耐药U251细胞（U251R）。

1.2.2 细胞分组与转染 将U251R细胞接种于无双抗、无血清培养基，置于5%CO2、饱和湿度、37℃恒温细胞培养箱中培养；待细胞融合度为60%～80%时，将U251R细胞分为DAC组、DAC干预的EGFR低表达组（KD组）、DAC干预的EGFR过表达组（OE组）和对照组；DAC组、KD组、OE组分别用阴性对照载体、EGFRKD载体、EGFR-OE载体转染48 h后，加入DAC；对照组为未经任何干预的U251R细胞。经上述处理后，将4组细胞置于培养箱内继续培养48 h。

1.2.3 细胞死亡比例测定 采用钙黄绿素和碘化丙啶双染色法，用1 ml PBS洗涤4组细胞3次后，按照细胞活性与细胞毒性检测试剂盒说明书，加入1 ml含有钙黄绿素和碘化丙啶的工作液，室温下孵育30 min。测定细胞死亡比例，并用德国徕卡DMi8荧光显微镜观察细胞死亡情况。

1.2.4 细胞凋亡比例测定 采用赫斯特染色法。用1ml PBS洗涤4组细胞3次后，加入1 ml含有赫斯特染料的工作液，置于室温下孵育30 min。测定细胞凋亡比例，并用德国徕卡DMi8荧光显微镜观察细胞凋亡情况。

1.2.5 EGFR、Bcl-2和Cleaved-Caspase 3蛋白表达水平检测 采用Western blot法，用1 ml PBS洗涤4组细胞3次后，每孔加入150 μl细胞裂解液，冰上裂解15 min，收集细胞裂解液，置于4℃离心机，12 000r/min，离心15 min，收集上清液进行蛋白定量。将20 μg总蛋白加入聚丙烯酰胺梯度凝胶进行电泳分离后，用全湿转膜法转移蛋白至聚偏氟乙烯膜，随后用3%脱脂奶粉封闭1 h，加入适量比例的EGFR、Bcl-2和Cleaved-Caspase 3抗体，置于4℃冰箱过夜。用洗涤液洗膜3次后，加入辣根过氧化物酶标记的二抗（稀释比例为1∶20 000）室温下孵育2 h；再次洗膜后，用增强化学发光法显影，采用Image J分析软件对蛋白条带进行半定量分析，比较4组细胞EGFR、Bcl-2和Cleaved-Caspase 3蛋白表达水平。

1.2.6 EGFR mRNA相对表达水平检测 采用实时荧光定量聚合酶链反应法，用1 ml PBS洗涤4组细胞3次后，加入1 ml Trizol试剂，提取总RNA。按照Prime Script RT Master Mix试剂盒说明书合成cDNA，用ABI 7500 PCR仪进行实时荧光定量PCR。EGFR的引物系列为：上游 5'-GCCCTCTGGAGCACCTCTACT-3'，下游5'-CATCTTGCACTGTTTGAGGTTGTAC-3'；GAPDH作为内参，引物系列为:上游5'-CTCCTCCTGTTCGACAGTCAGC-3'，下 游 5'-CCCAATACGACCAAATCCGTT-3'。应用2-ΔΔCt法计算EGFR mRNA相对表达水平，比较4组细胞EGFR mRNA相对表达水平。

1.3 统计学处理 采用SPSS 22.0统计软件。计量资料以表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 4组细胞死亡比例比较 4组细胞死亡比例比较，差异有统计学意义（F=58.48，P＜0.01）。DAC组和KD组的细胞死亡比例为（53.11±7.96）%和（61.98±9.10）%，均高于对照组的（7.41±4.53）%，OE组细胞死亡比例为（6.70±3.22）%，低于DAC组，差异均有统计学意义（均P＜0.05）。显微镜下可见死细胞被碘化丙啶染色，呈红色，活细胞被钙黄绿素染色，呈绿色，见图1（插页）。

2.2 4组细胞凋亡比例比较 4组细胞凋亡比例比较，差异有统计学意义（F=12.67，P＜0.01）。DAC组、KD组细胞凋亡比例为（15.23±1.56）%和（18.36±5.96）%，均高于对照组的（2.96±1.54）%，OE组细胞凋亡比例为（1.63±1.30%），低于DAC组，差异均有统计学意义（均P＜0.05）。显微镜下可见凋亡的细胞核被赫斯特染料致密浓染，显微镜下呈亮蓝色，见图2（插页）。

2.3 4组细胞EGFR、Bcl-2和Cleaved-Caspase 3蛋白表达水平比较 4组细胞EGFR、Bcl-2和Cleaved-Caspase 3蛋白表达水平比较，差异均有统计学意义（均P＜0.01）。DAC组和KD组细胞EGFR、Bcl-2蛋白表达水平均低于对照组，Cleaved-Caspase 3蛋白表达水平高于对照组，差异均有统计学意义（均P＜0.05）。OE组细胞EGFR、Bcl-2蛋白表达水平高于DAC组，Cleaved-Caspase 3蛋白表达水平低于DAC组，差异有统计学意义（均P＜0.05），见表1。4组细胞EGFR、Cleaved-Caspase 3和Bcl-2蛋白表达水平的电泳图见图3。

图3 4组细胞EGFR、Cleaved-Caspase 3和Bcl-2蛋白表达的电泳图（a：EGFR蛋白表达的电泳图，b：Bcl-2和Cleaved-Caspase 3蛋白表达的电泳图）

表1 4组细胞EGFR、Bcl-2和Cleaved-Caspase3蛋白表达水平比较

2.4 4组细胞EGFR mRNA相对表达水平比较 4组细胞EGFR mRNA相对表达水平比较，差异均有统计学意义（F=434.80，P＜0.01）。DAC组、KD组细胞EGFR mRNA相对表达水平为0.22±0.05和0.12±0.04，低于对照组的1.00±0.03，差异均有统计学意义（均P＜0.05）；OE组细胞EGFR mRNA相对表达水平为2.40±0.16，高于DAC组，差异有统计学意义（P＜0.05）。

3 讨论

DAC是一种咪唑喹啉衍生物，可有效地抑制细胞增殖，对肿瘤生长、转移有抑制作用，常用于辅助增加抗癌药物的灵敏度[9]。近年来，报道称DAC能诱发化疗药物耐药细胞死亡，还能抑制酪氨酸受体抑制剂耐药肿瘤细胞增殖[6，10-11]。Durrant等[6]发现 DAC 能逆转卵巢癌和胰腺癌细胞阿霉素耐药性。Yu等[11]研究表明DAC可诱发奥沙利铂耐药结直肠癌细胞死亡；Sano等[10]证实DAC能抑制埃罗替尼耐药肺癌细胞增殖。本研究结果显示，DAC组和KD组的细胞死亡比例高于对照组，差异均有统计学意义，与Yu等[9]结果一致，说明DAC能够诱发U251R细胞死亡，可用于缓解TMZ耐药。细胞凋亡是一种程序性细胞死亡，激活细胞凋亡途径是DAC发挥抗肿瘤活性重要机制之一。研究发现，DAC干预后Bcl-2蛋白表达水平降低，细胞凋亡比例增加，但这种效应可被细胞凋亡抑制剂阻断[12]。DAC还可损害细胞线粒体功能，增加细胞内活性氧含量，诱发细胞凋亡[13]。本研究结果显示，DAC组和KD组的细胞凋亡比例、Cleaved-Caspase 3蛋白表达水平均高于对照组，DAC组、KD组细胞Bcl-2蛋白表达水平低于对照组，差异均有统计学意义。由此说明，DAC能够打破凋亡相关蛋白之间的平衡关系，诱发U251R细胞凋亡，与Zhu等[14]的研究结果一致。

EGFR是一种酪氨酸激酶型受体，与配体结合后可发生构象变化，暴露磷酸化位点，发生自身磷酸化。随后，磷酸化的EGFR能够募集并激活PI3K，从而激活蛋白激酶B和哺乳动物雷帕霉素靶点复合物，进而调节细胞代谢、存活，抵抗药物损伤[15-17]。研究表明TMZ耐药的细胞中，EGFR磷酸化水平增加，能持续激活PI3K-蛋白激酶B信号通路[5]。报道称PI3K或蛋白激酶B抑制剂能够抑制EGFR及其突变体表达，缓解EGFR抑制剂耐药[18]。也有报道称哺乳动物雷帕霉素靶点复合物抑制剂与TMZ联合应用能够发挥协同抗恶性胶质瘤的作用[19]。

本研究中DAC组细胞EGFR蛋白表达水平和mRNA相对表达水平低于对照组，差异有统计学意义，与Wu等[8]结果一致。OE组细胞死亡比例、细胞凋亡比例低于DAC组，差异有统计学意义，由此说明DAC能够通过降低EGFR表达，缓解TMZ耐药，但EGFR持续过表达能够阻断DAC诱导U251R细胞死亡和凋亡。EGFR药理学抑制剂可作为增敏剂用于提高TMZ抗恶性胶质瘤灵敏度，为后续研究提供了科学依据。